本发明专利技术涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。通过对GHR从基因、蛋白质、酶活性等多方面的研究,必然会为糖尿病、部分肝病、肾功能不全、侏儒症、巨人症等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。本发明专利技术参考其它物种GHR基因序列，克隆测序获得双峰驼GHR基因的cDNA序列，并对不同物种GHR基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证GHR基因的结构特点，为今后研究GHR基因与双峰驼物质代谢的关系提供基础资料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，是一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
技术介绍
生长激素受体(growthhormone receptor,GHR)是生长激素(growth hormone,GH)的受体蛋白，由于生长激素为生物大分子，不能直接透过细胞膜，必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能。生长激素受体是由单一基因编码的，含有620个氨基酸的单链跨膜糖蛋白，其胞外区，跨膜区及胞内区分别是由约246 ,24，350个氨基酸残基组成。它属于细胞因子P造血因子受体超家 族的成员之一，与其他受体具有相似的结构和功能，尤其胞外区约200个氨基酸具有较显著的同源性。1987年，Lueng从兔肝脏中提取并纯化出GHR，又根据氨基酸序列首次从兔的肝脏cDNA文库中克隆出GHR cDNA。随后人们相继克隆了人、小鼠、大鼠、绵羊、牛、鸡等20多种动物的GHR cDNA，大多数哺乳动物的GHR基因由10个外显子和9个内含子组成。生长激素能促进人的生长，且能调节体内的物质代谢。它主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖，同时促进肝脏中的糖异生作用及对糖元进行分解，从而使血糖升高。还可促进脂肪分解，使血浆游离脂肪酸升高。饥饿时胰岛素分泌减少，生长激素分泌增高，于是血中葡萄糖利用减少及脂肪利用增高，此时血浆中葡萄糖及游离脂肪酸含量上升。由于生长激素必须通过与位于靶细胞膜上的GHR结合，经过介导体将信息传递到细胞内，才能发挥其生物学功能，所以，组织中GHR含量多少，功能正常与否都影响GH生理效应得以发挥，导致动物生长发育模式的变异。GHR在机体的生长和体内的物质代谢中有着关键的调控作用，双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双峰驼GHR蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，GHR蛋白即生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)是生长激素(growth hormone,GH)的受体蛋白，克服了上述现有技术之不足，通过对GHR从基因、蛋白质、酶活性等多方面的研究，必然会为糖尿病、部分肝病、肾功能不全、侏儒症、巨人症等疾病的预防和治疗带来新的希望。双峰驼有比较特殊的生理特性，尤其是在抗干旱耐饥渴等方面，很适合进行物质代谢研究。本专利技术的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼GHR蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。本专利技术中的双峰驼GHR蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的GHR蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼GHR蛋白基因cDNA序列见 SEQ ID NO.1。下面是对上述专利技术技术方案之一的进一步优化或/和改进 上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1746bp，电泳结果见附图1，其中33-35位为起始密码子ATG，1734-1736位为终止密码子TAG，33-1736位为编码蛋白质区域(CDS)。本专利技术的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。下面是对上述专利技术技术方案之二的进一步优化或/和改进 上述重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。将双 峰马它GHR蛋白基因cDNA序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。上述重组蛋白为具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- 5，- ATGGGCAATACTTTCCTC -3，， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。本专利技术的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行 第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取； 第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGGGCAATACTTTCCTC -3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)=Oligo dT ； 第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增； 第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。本专利技术参考其它物种GHR基因序列，克隆测序获得双峰驼GHR基因的cDNA序列，并对不同物种GHR基因的CDS序列进行同源性比较，旨在了解和验证GHR基因的结构特点，为今后研究GHR基因与双峰驼物质代谢的关系提供基础资料。附图说明附图1为双峰驼GHR蛋白基因RT-PCR产物电泳图。附图2为构建系统发生树所用GHR蛋白氨基酸同源性比较。附图3为不同物种GHR蛋白氨基酸序列系统进化树。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步描述 实施例1，一种双峰驼GHR蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。可根据实际需要，对上述A作进一步优化或/和改进 双峰驼GHR蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中33-1736位的序列。实施例2，一种双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。可根据实际需要，对上述双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进 重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。 重组蛋白为具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- 5，- ATGGGCAATACTTTCCTC -3，， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ； 实施例3，一种双峰驼GHR蛋白基因的克隆方法按下述步骤进行 第一步，总RNA提取1.组织分离(Isolation) 从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation) (I)提取RNA的准备工作 玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双峰驼GHR蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种双峰驼GHR蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。2.根据权利要求1所述的双峰驼GHR蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有 SEQ ID NO.1 中 33-1736 位的序列。3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼GHR蛋白基因的重组蛋白。4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQID NO. 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼GHR 蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGGGCAATACTTTCCTC -3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼GHR蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈钢粮，
申请(专利权)人：新疆旺源驼奶实业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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