一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物及其应用，属于分子病理诊断领域，包括SEQ ID NO：1～2所示的扩增引物、SEQ ID NO：3所示的测序引物、所示的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同；其中，SEQ ID NO：2其5’端标记生物素；SEQ ID NO：4其3’端磷酸化处理；以上核酸序列在一次检测中共同使用。本发明专利技术提高了检测灵敏度高，可检测低至0.1％的突变，而且结果直观，判读更加简单、准确、快速，大大降低检测结果的假阴性率，避免临床上对患者无益或有益的靶向药物选择，为患者节省宝贵的治疗时间，提高患者生活质量。

【技术实现步骤摘要】
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变引物及其应用
本专利技术属分子病理诊断领域，具体涉及一种用于准确定性检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的引物及其应用。
技术介绍
肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌症死因的第一名，1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年，肺癌中75％～80％为非小细胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化疗等治疗手段不仅降低了生存质量，且疗效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼Gefitinib)是目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TyrosineKinaseinhibitors，TKI)，临床试验证实对东方人(亚洲人为主)、女性、非吸烟者、肺泡细胞癌或腺癌患者的疗效较好。进一步的研究表明，非小细胞肺癌患者EGFR基因上携带20外显子上T790M突变型患者则对易瑞沙耐受，而对AZD9291靶向药物敏感。目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量PCR，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1-5％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。但是针对临床上一些特殊标本，如血浆、胸腹水等来源的标本，5％的检测灵敏度远远不够。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变试剂盒，以解决现有技术中表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测结果准确率低的缺点。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的如下技术方案：一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物，包括：SEQIDNO：1～2所示的扩增引物、SEQIDNO：3所示的测序引物、SEQIDNO：4所示的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同；其中，SEQIDNO：2其5’端标记生物素；SEQIDNO：4其3’端磷酸化处理；以上核酸序列在一次检测中共同使用。其中，所述扩增阻滞引物的序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术中，通过引入扩增阻滞引物，降低了野生型序列的扩增，相对增加了突变基因型的扩增，结合焦磷酸测序技术大大提高了检出灵敏度。相比于现在临床上普遍采用的ARMS检测EGFRT790M的方法(1％灵敏度)，检测灵敏度提高至0.1％，提高了临床标本的阳性检出率，可以为更多的患者提供了准确的用药参考。一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒，包括权利要求1～4所示的引物以及如下试剂：(1)DNA提取试剂；(2)生物素标记亲和磁珠；(2)反应液：PCR缓冲液，2mMMgCl2，0.2mMdNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶；(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mMpH7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。其中，所述PCR缓冲液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mLBSA，0.1％(v/v)吐温-20，0.06MpH8.9Tricine。其中，所述的缓冲液包括：10mMTris-HCl，2MNaCl，1mMEDTA，0.1％(v/v)吐温-20。其中，所述的退火缓冲液包括：20mMpH7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐，2mM醋酸镁。一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法，包括如下步骤：(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA；(2)以步骤(1)中所得DNA为模板，PCR扩增EGFRT790M位点核酸序列片段；(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；(5)测序得到SNP突变频率。上述检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法，步骤(2)中，PCR扩增体系为：10×PCRbuffer5μL，SEQIDNO：10.5μL，SEQIDNO：20.5μL，SEQIDNO.：45uL，TemplateDNA3μl，0.2mΜdNTPs，2mMMgCl2，TaqDNA聚合酶2U，加无菌水补足至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。有益效果：本专利技术的一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测方法和试剂盒，应用焦磷酸测序技术可以准确检测突变该位点的突变，可用于临床启动EGFR-TKI用于治疗非小细胞肺癌前的靶标位点EGFRT790M突变检测，筛选药物敏感和耐药的患者。本专利技术方法操作简单，敏感性高，降低了样本取材要求，结果易于判读，大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率，为患者避免无效有害的治疗，节省宝贵的治疗时间。本专利技术通过对EGFR基因型序列分析，设计了特异的生物素标记引物，利用PCR和焦磷酸测序技术，准确检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变。该方法可快速准确的检测低至0.1％的EGFRT790M突变。其重要意义在于：(1)指导肺癌患者有针对性用药，避免无效用药；(2)改善预后；(3)避免获得耐药；(4)降低对样本组织的取材要求；(5)减少医疗费用。附图说明图示1为突变频率为20％的标准品，经本方法检测后突变频率变为82.5％。图示2为突变频率为2％的标准品，经本方法检测后突变频率变为10.1％。图示3为突变频率为0.2％的标准品，经本方法检测后，突变频率变为4.5％。图示4为一例石蜡组织标本检测结果。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：试剂。(1)DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物，其特征在于，包括：SEQ ID NO：1～2所示的扩增引物、SEQ ID NO：3所示的测序引物、所示的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同；其中，SEQ ID NO：2其5’端标记生物素；SEQ ID NO：4其3’端磷酸化处理；以上核酸序列在一次检测中共同使用。

【技术特征摘要】
1.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物，其特征在于，包括：SEQIDNO：1～2所示的扩增引物、SEQIDNO：3所示的测序引物、所示的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同；其中，SEQIDNO：2其5’端标记生物素；SEQIDNO：4其3’端磷酸化处理；以上核酸序列在一次检测中共同使用。2.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物，其特征在于，所述扩增阻滞引物的序列如SEQIDNO：4所示。3.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4所示的引物以及如下试剂：(1)DNA提取试剂；(2)生物素标记亲和磁珠；(2)反应液：PCR缓冲液；引物SEQIDNO：1～410μM；2mMMgCl2，0.2mMdNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶；(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mMpH7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。4.根据权利要求3所述的检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mLBSA，0.1％(v/v)吐温-20，0...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，张锋，虞闰六，曹子豪，周韵，
申请(专利权)人：杭州迪安医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33