一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒。本发明专利技术设计一对全新的通用检测引物，以生鲜的肌肉组织为材料提取DNA，对提取DNA的方法进行了优化，结合二代测序技术，一次性检测出多种肉源性成分，并且还能够检出未知的肉源性成分，无需每种肉源性成分对应一套特异性引物和探针；能一次性检出多种肉源性成分；省去纯化、连接、转化等繁琐的操作步骤；准确地检出未知的肉源性成分，且重复性高。其检测结果与传统的克隆测序方法相比，更全面，更高灵敏度，具有更广的适用性，可应用于多种肉源性成分的鉴定、未知肉源性成分的溯源和微量肉源性成分的检出。

【技术实现步骤摘要】
一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物、方法及试剂盒
：本专利技术属于生物
，具体涉及一种能够一次性检测多种肉源性成分的检测引物、检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
：对于肉源性成分的鉴定，普遍使用的是实时荧光定量PCR方法。该方法有较高的灵敏度，适合加工食品微量肉源成分检测，且能相对定量，因此该方法被广泛使用。但该方法存在一定的缺点，如有些物种的特异性探针和引物难以设计，以及一套探针、引物对应某特定的单一的物种成分。为解决这一问题，也有人使用通用引物和克隆测序方法，对多种肉源性成分进行检测。但这种方法需筛选阳性克隆，工作量大、成本高、还存在漏检的情况。而关于混合样品的检出方法，如多重PCR、限制性片段多态法(RFLP)、和单链构象多态(SSCP)、随机扩增多态片段法(RAPD)都属于传统的检测方法，前三种方法不能检测样品中未知的肉源性成分，而RAPD-PCR法则存在重复性差和假阳性、假阴性等问题。如今，二代测序技术为物种鉴定的研究提供了一种新型的方法，并已经广泛应用于环境微生物的宏基因组的研究。因其高通量的优势可对混合样品中多种的、未知的物种成分进行鉴定。但由于二代测序有读长限制，对于100bp以上的序列，测序准确率会降低，而且混合样品不能直接用标准的DNA条形码(>500bp)进行物种鉴定，否则多重复片段的拼接会大大增加错误率。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种快速、灵敏、重复性高地检测多种肉源性成分的检测引物、检测方法及检测试剂盒，本专利技术设计一对全新的通用检测引物，以生鲜的肌肉组织为材料提取DNA，对提取DNA的方法进行了优化，结合二代测序技术，一次性检测出多种肉源性成分，并且还能够检出未知的肉源性成分，达到快速、灵敏、省时省力且准确度高的效果，从而实现了本专利技术的目的。本专利技术的一次性检测多种肉源性成分的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC本专利技术的一次性检测多种肉源性成分的检测试剂盒，包括PCR反应液、Ex-TaqDNA聚合酶、裂解缓冲液、TE缓冲液、苯酚、和检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC所述的裂解缓冲液为10mmol/LpH8.0的Tris-HCl，0.1mol/LpH8.0的EDTA和质量体积比(m/V)为0.5％的SDS。所述的TE缓冲液为100mmol/LpH8.0的Tris-HCl和10mmol/LpH8.0的EDTA。所述的苯酚为经0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡到pH值为8.0。本专利技术的一次性检测多种肉源性成分的检测方法，用于检测肉类食品或者其他的混和的动物样品的物种鉴定，其特征在于，包括以下步骤：(1)、采用蛋白酶K-苯酚法提取肉类样品的基因组DNA，具体为：将肉类样品研磨成肉糜，加入裂解缓冲液，每200μL的裂解缓冲液对应加20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，水浴，再加入等体积的经0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡的苯酚，其pH值平衡到8.0，离心分离两相，转移水相再用苯酚抽提两次，收集水相再次用苯酚抽提第三次，转移水相加入醋酸铵及乙醇，离心收集DNA沉淀，70％酒精洗涤离心，加入TE缓冲液溶解产物，得到样品的基因组DNA提取液；(2)、使用上述检测引物、PCR反应液及Ex-TaqDNA聚合酶对基因组DNA进行PCR扩增，得到目的扩增片段；(3)、采用二代测序方法对上述目的扩增片段进行测序以明确样品中含有哪些肉源性成分。所述的PCR扩增，优选，PCR扩增反应体系为：每50μL的反应体系中含有10×PCRBuffer5μL、正向引物(20nmol/μL)1μL、反向引物(20nmol/μL)1μL、dNTP(2.5mM)2μL、Ex-Taq(5U/μL)1μL、模板DNA(50ng/μL)5μL，并最终用双蒸水定容到50μL。所述的PCR扩增，优选，PCR扩增反应程序为：94℃变性3min，98℃、10s；48℃、30s；68℃、1min；30个循环，68℃延伸7min。所述的二代测序，优选，先测定各样品PCR产物的目的DNA片段的浓度，对于检测合格的样品构建文库，再用合格的文库进行cluster制备和高通量测序；测序采用IlluminaHiSeq4000平台和PE150bp的测序策略，以及Q20(>85％)策略对测序的准确性进行控制；测序后对原始数据进行过滤处理，过滤低质量的reads，剩余高质量的序列(有效序列)用于后期分析；由原始序列数和有效序列数得出序列的有效利用率，以判断测序质量和DNA提取的效果，再做后续的序列聚类和注释；把97％相似度的有效序列聚成同一个操作分类单元(Operationaltaxonomicunit，OTU)，然后通过OTU与数据库比对进行序列的物种注释；注释后，省去与库中参考序列低于98％相似度的序列，以保证序列物种注释的准确性。本专利技术由原始序列数和有效序列数得出序列的有效利用率为96.59％，反映了测序质量和DNA提取的效果较好。OTU序列注释后，有98.18％的有效序列能准确鉴定到对应的物种，能与参考序列达到高于98％的相似度。本专利技术相对于现有技术方法具有如下的优点及效果：无需每种肉源性成分对应一套特异性引物和探针；能一次性检出多种肉源性成分；省去纯化、连接、转化等繁琐的操作步骤；准确地检出未知的肉源性成分，且重复性高。其检测结果与传统的克隆测序方法相比，更全面，更高灵敏度，具有更广的适用性，可应用于多种肉源性成分的鉴定、未知肉源性成分的溯源和微量肉源性成分的检出。附图说明：图1是样品肉源性成分的克隆测序结果；图2是样品肉源性成分的二代测序结果，各个物种的百分比源于三个平行样品中各个物种百分比的均值。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：一、通用检测引物的设计从NCBI数据库中获取45个远缘物种序列，涵盖了哺乳动物(n＝14)、鱼类(n＝19)、鸟类(n＝8)和甲壳纲类(n＝4)。在标准DNA条形码COI的基础上，经软件分析，选出较理想的区域片段miniCOI，长度为136bp，既能满足一般的二代测序平台的读长限制，又具有适度的变异性使不同的物种得以区分，以及良好的保守性使同种个体聚类。引物与模板序列的保守性：经多序列比对后，得出引物的保守碱基(阴影标记)，与标准DNA条形码COI的通用引物相比，新设计的引物与模板间有更好的保守性，体现了该引物具有较好的通用性。MiniCOI序列的引物(本专利技术的通用检测引物)：F(5’-3’)R(5’-3’)GGAAAATATATT--------AGGTTAG标准COI序列的引物：F(5’-3’)R(5’-3’)GGAAAATATATT--------ATAGAAATC二、检测1、基因组DNA提取用传统的试剂盒提取全基因组DNA时，以过柱方式获取膜上DNA会产生约30％的损失，会对混合样品中微量DNA成分的检测产生一定的影响。而优化后提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC。

【技术特征摘要】
1.一种一次性检测多种肉源性成分的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC。2.一种一次性检测多种肉源性成分的检测试剂盒，包括PCR反应液、Ex-TaqDNA聚合酶、裂解缓冲液、TE缓冲液、苯酚和检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：正向引物F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG反向引物R:ACTATAAAGAAGATTATTACAAAGGC所述的裂解缓冲液为10mmol/LpH8.0的Tris-HCl，0.1mol/LpH8.0的EDTA和质量体积比(m/V)为0.5％的SDS。所述的TE缓冲液为100mmol/LpH8.0的Tris-HCl和10mmol/LpH8.0的EDTA。所述的苯酚为经0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡到pH值为8.0。3.一种一次性检测多种肉源性成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、采用蛋白酶K-苯酚法提取肉类样品的基因组DNA，具体为：将肉类样品研磨成肉糜，加入裂解缓冲液，每200μL的裂解缓冲液对应加20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，水浴，再加入等体积的经0.1mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡的苯酚，其pH值平衡到8.0，离心分离两相，转移水相再用苯酚抽提两次，收集水相再次用苯酚抽提第三次，转移水相加入醋酸铵及乙醇，离心收集DNA沉淀，70％酒精洗涤离心，加入TE缓冲液溶解产物，得到样品的基因组DNA提取液；(2)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳巧云，潘艳义，陈健，邱德义，单振菊，刘德星，魏晓雅，李婷婷，
申请(专利权)人：中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44