一种青稞TIFY9基因的克隆表达方法技术

本发明专利技术提供了一种青稞TIFY9基因的克隆和表达方法，具体提供了从青稞RNA反转录得到TIFY9基因cDNA的逆转录PCR方法、TIFY9基因的PCR方法以及TIFY9基因的表达方法，为下一步的品种筛选和育种提供了有益的选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因克隆与蛋白表达领域，具体公开了TIFY9基因的克隆及表达方法。
技术介绍
TIFY是一类新发现的植物中特有的基因家族，该家族基因由于编码蛋白序列中含有高度保守的TIF(F/Y)XG氨基酸序列，所以被命名为TIFY家族。目前的研究表明TIFY类基因受到了机械损伤、臭氧等非生物胁迫的诱导表达。在拟南芥中已经发现JAZ10/TIFY9能够被伤胁迫和茉莉酸诱导表达。水稻中的TIFY家族基因有20个成员，其中有9个被茉莉酸诱导，几乎全部会被诸如盐、干旱、低温等非生物胁迫诱导，这表明TIFY家族与盐碱、干旱等有着密切的关系，对于包括TIFY9在内的TIFY基因家族进行深入的研究对于植物的耐盐、机械损伤胁迫的生理研究以及农业生产具有重要的意义。尽管从2007年开始，人们对于拟南芥以及水稻中的TIFY家族基因进行了一定的研究，但是在青稞这种重要的粮食作物中的研究尚属空白，本次对TIFY9进行基因克隆与蛋白的表达将会为该基因在青稞中的研究提供极大的便利，为该粮食作物的增城提供有益的帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的包括：提供一种一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法；提供了一种TIFY9基因的PCR方法；提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9；提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的制备方法；提供一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的表达方法。具体的，本专利技术公开了一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RTReactionMix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscriptH-RTase/RIMix和8.6uL的8.6uL，混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)得到cDNA，-20℃保存。其中，步骤(1)采用植物RNA试剂盒提取总RNA；步骤(2)采用反转录试剂盒进行反转录。本专利技术还提供了一种TIFY9基因的PCR方法，包括以下步骤：(1)按表1所示的反应体系，在微量离心管中加入TIFY9基因cDNA与引物1、引物2，引物1和引物2的核苷酸序列分别如序列表SEQNOID.1、SEQNOID.2所示；(2)PCR反应条件：95℃5min预变性后进入循环；循环条件为：94℃1分钟,58℃1分钟，72℃1分钟；循环30次后，于72℃延伸10分钟。表1PCR反应体系此外，本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9，其核苷酸序列如序列表SEQNOID.5所示。同时，本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的制备方法，包括以下步骤：(1)pET28a载体与扩增得到的TIFY9基因用BamHI与Xhol进行双酶切，酶切条件如表2所示；表2pET28a载体和TIFY9基因的酶切条件(2)取步骤(1)得到的pET28a载体酶切产物和TIFY9基因酶切产物，分别进行1％琼脂糖电泳后使用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；(3)取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，分别加入步骤(2)得到的pET28a(+)酶切回收片段4.5μl、TIFY9酶切回收片段0.5μl、的T4DNA连接酶缓冲液5.0μl，16℃连接过夜。另一方面，本专利技术还提供了一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的表达方法，包括以下步骤：(1)将重组表达质粒pET28a-TIFY9转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞；同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照；(2)挑取LB固体培养基(含Kan100ug/mL)上生长的已转化入pET28a-TIFY9的BL21(DE3)菌落接种于5mLLB液体培养基(含Kan100ug/mL)；(3)37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1:100比例接种于含Kan的LB液体培养基中；(4)将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加IPTG诱导表达，另一份不加IPTG作为对照；加入IPTG至终浓度为1mmol/L，转速为220rpm，继续25℃培养16h；(5)取IPTG诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE；对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况；同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。本专利技术首次公开了从青稞植物中提取RNA克隆TIFY9基因的方法，根据本专利技术提供的方法可有效的获得和表达TIFY9基因，为下一步的品种培育和筛选提供了有益选择。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。以下通过实施例形式的具体实施方法，对本专利技术的上述内容在做进一步的详细说明，但不应理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1酶切验证实验图谱M:DNA分子量marker1：pET28-TIFY9的BamHI与XhoI双酶切产物图2a、图2bPET28-TIFY9测序结果与已知目的基因的序列比对14TIFY910020455为基因组TIFY9基因14-1T7为重组表达质粒Pet28a-TIFY9图3pET28a-TIFY9在BL21中蛋白表达的SDS-PAGE电泳图谱M：标准蛋白分子量1：含载体Pet28a-TIFY9菌未诱导2：含载体Pet28a-TIFY9菌诱导3：含载体Pet28a-TIFY9菌诱导上清4：载体Pet28a-TIFY9菌诱导沉淀以下为具体实施方式第一RNA抽取及cDNA逆转录PCR1.RNA抽提及反转录1.1用青稞320及喜8种子发芽成长成苗1.2采取新鲜叶片用植物提取试剂盒抽提RNA并检测，1.3提取步骤如下：1.3.1仪器与试剂主要仪器：SCILOGEXD3024R离心机、analytikjena-Easycycler；Scientz-48高通量组织研磨仪；主要试剂：反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)(艾德来,货号PC1802，)；2×预混液(德国DBIpcrMix)。1.3.2实验方法与步骤1.3.2.1组织样本中RNA的提取RNA提取试剂盒采用jenainnuPREPRNAMiniKit。1.3.2.2cDNA的合成(反转录)采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)进行反转录操作，采用20uL反应体系(各反应500ul体系用于后续PCR)：反转录反应条件如下：反应结束后，得到cDNA，-20℃保存。2.GIFY9基因的PCR扩增2.1按表1所示的反应体系，在微量离心管中加入TIFY9基因cDNA与引物1、引物2，引物1和引物2的核苷酸序列分别如序列表SEQN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RT Reaction Mix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscript H‑RTase/RI Mix和8.6uL的8.6uL，混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)得到cDNA，‑20℃保存。

【技术特征摘要】
1.一种青稞TIFY9基因cDNA的反转录PCR方法，包括以下步骤：(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RTReactionMix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscriptH-RTase/RIMix和8.6uL的8.6uL，混匀，离心；(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；(4)得到cDNA，-20℃保存。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用植物RNA试剂盒提取总RNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用反转录试剂盒进行反转录。4.一种TIFY9基因的PCR方法，包括以下步骤：(1)按表1所示的反应体系，在微量离心管中加入TIFY9基因cDNA与引物1、引物2，引物1和引物2的核苷酸序列分别如序列表SEQNOID.1、SEQNOID.2所示；表1PCR反应体系(2)PCR反应条件：95℃5min预变性后进入循环；循环条件为：94℃1分钟,58℃1分钟，72℃1分钟；循环30次后，于72℃延伸10分钟。5.一种重组表达质粒pET28a-TIFY9，其核苷酸序列如序列表SEQNOID.5所示。6.一种重组表达质粒pET28a-TIFY9的制备方法，包括以下步骤：(1)pET28a载体与扩增得到的TIFY9基因用BamHI与Xhol进行双酶切，酶切条件如表2所示；表2pET28a载体和TIFY9基因的酶切条件(2)取步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾兴权，原红军，徐齐君，韦泽秀，王玉林，扎桑，白丽军，尼玛扎西，
申请(专利权)人：西藏自治区农牧科学院，成都生命基线科技有限公司，
类型：发明
国别省市：西藏;54