锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用制造技术

本发明专利技术公开了锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用。本发明专利技术人利用植物基因克隆技术从番茄中克隆得到一个新基因SlZF3，其核酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码序列为SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，分子量为17kD。本发明专利技术人首次发现，通过转基因技术将锌指蛋白在植物中过量表达，可显著提高植物中维生素C的含量。因此，本发明专利技术不仅提供了锌指蛋白的用途，还提供了一套植物高维生素C含量育种的技术方案，具备广泛的推广价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利属于植物基因工程领域。具体涉及一种从番茄(Solanum lycopersicum L.)中分离、克隆到一个编码C2H2类型锌指蛋白的基因，还涉及锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用。
技术介绍
维生素C又叫L-抗坏血酸，因有抗坏血病毒作用而得名。它是一种水溶性维生素，水果和蔬菜中含量丰富，是一种重要的抗氧化剂。人体不能合成维生素C，必须通过绿色蔬菜和水果食物补充。维生素C是人体胶原合成的重要成分，同时也是儿茶酚胺类、胆固醇、氨基酸和多肽类激素等物质合成的辅因子。维生素C在氧化还原代谢反应中起重要作用，维生素C对癌症和心血管疾病等具有预防效果。因此，维生素C对人类健康起着重要作用。植物中存在多条维生素C合成途径，包括D-甘露糖醇/L-半乳糖途径，D-半乳糖醛酸酯途径，D-葡糖酮醛途径以及肌糖途径。其中D-甘露糖醇/L-半乳糖途径是植物最重要的维生素C合成途径，而GDP-甘露糖焦磷酸化酶(在拟南芥中称为VTC1，在番茄中称为GMP)处于该途径较上游的节点，对维生素C的合成具有重要作用。拟南芥VTC1突变体因该酶的活性降低而导致维生素C的含量显著降低。维生素C的合成代谢研究一直广受关注，且其合成代谢途径已基本阐明，但参与该途径的调节因子研究则较少。其中，AMR1是拟南芥中第一个被鉴定到的负调控因子，它可以负调控维生素C的代谢。超量表达AMR1可以降低维生素C的含量，相反，在AMR1敲除材料中维生素C的含量明显上升。另外，拟南芥COP9信号复合体亚基5B(CSN5B)通过与VTC1互作能够在黑暗环境中通过26S蛋白酶降解途径促使VTC1降解，从而负调控维生素C的合成。相反，在COP9信号复合体亚基5B(CSN5B)的突变体中可以积累更多的维生素C。此外，番茄SlHZ24可以结合在维生素C合成途径下游的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因启动子区域，从而促进该基因的表达，正调控维生素C的合成，在番茄中超量表达S lHZ24可以显著提高维生素C的含量。转录因子又称反式作用因子，是能与真核基因启动子区域特异性相互作用的DNA结合并调控基因表达的蛋白。转录因子调控着动植物生命活动的方方面面。植物中存在几十个不同类型的转录因子家族，其中，锌指蛋白是一类数量丰富的转录因子，它在基因表达调控、细胞分化、增强植物抗逆性等方面具有重要的作用。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子。锌指蛋白中的一小段氨基酸区域中含有
几个半胱氨酸残基(C)，而这些区域是依赖锌的DNA结合域，通过结合锌离子从而自我折叠形成短而稳定的手指状结构。锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA-RNA的序列特异性结合，它也可以通过与自身或其他锌指蛋白结合，在转录和翻译水平上调控基因的表达。根据锌指结构域的半胱氨酸残基和组胺酸(H)的数量和顺序，锌指蛋白可分为C2H2、C2HCC2C2C2C2、C2HC、C2C2C2C2和CCCH等类型，其中C2H2类的锌指蛋白是植物中含量最丰富的一类锌指蛋白。如拟南芥中至少有176个成员，在番茄中至少有99个成员，在水稻中有189个成员，在玉米中有211个成员，在番木瓜中有87个成员。C2H2类的锌指蛋白包含两个锌指结构域，每一个结构域都含有一个保守的β-β-α结构，这种结构中心含有一个锌离子，锌离子可以使锌指结构保持稳定和行使正常的生物功能。迄今为止，还没有关于锌指蛋白调控维生素C合成的研究报道。本专利技术人首次发现锌指蛋白可以正调控维生素C的合成。在番茄和拟南芥模式植物中，其作用机理是锌指蛋白通过与GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶竞争结合COP9信号复合体亚基5B，抑制其与GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的互作，从而抑制COP9复合体对VTC1的降解作用。锌指蛋白在改良经济作物维生素C含量中所起的作用不可小视。
技术实现思路
本专利技术目的是提供了锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用，通过常规转基因技术在植物中过表达锌指蛋白，可显著提高植物中维生素C的含量。本专利技术的另一个目的是提供一种从番茄(Solanum lycopersicum L.)中分离、克隆到一个编码C2H2类型锌指蛋白的基因，申请人将此基因命名为SlZF3，其基因序列为SEQ ID NO.1所示，其CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。为了达到以上目的，本专利技术采用以下技术方案实现：锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用，其应用过程包括利用本领域的常规方式将锌指蛋白在植物中过量表达(或者诱导表达或者组织特异表达)，即可获得维生素C含量提高的目的植株。优选的，所述的锌指蛋白为C2H2类型的锌指蛋白。优选的，所述的C2H2锌指蛋白为番茄SlZF3蛋白，其序列为SEQ ID NO.3所示。优选的，所述的植物为经济作物。优选的，所述经济作物为蔬菜作物。优选的，所述蔬菜作物为番茄、马铃薯、甘蓝或生菜。应理解，在本专利技术范围内中，只要能与GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶竞争性结合COP9信
号复合体亚基5B(CSN5B)的锌指蛋白均能用于提高植物维生素C含量，通过各技术特征之间的互相组合，从而可以构成新的或者优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。所述的番茄SlZF3蛋白对应的核苷酸序列为本申请人利用植物基因克隆技术从番茄中克隆的到一个新基因SlZF3，其核酸序列为SEQ ID NO.1所示，共718bp，其中68-533bp处为该基因的编码区，包括465bp的开放阅读框，编码155个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示，分子量为17kD。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术利用新技术策略通过转基因手段得到维生素C含量提高的转基因植株，突破了传统育种手段的障碍；此外，本专利技术所利用的基因在模式植物拟南芥和番茄中都能显著提高维生素C的含量，并且其作用机理适用于所有的锌指蛋白。附图说明图1.显示了番茄的锌指蛋白转基因系中维生素C(抗坏血酸，AsA)的含量。图2.显示了拟南芥的锌指蛋白转基因系中维生素C(抗坏血酸，AsA)的含量。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现了锌指蛋白通过与GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶竞争结合COP9信号复合体亚基5B(CSN5B)，从而抑制该复合体对GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶的降解作用，进而促进植物维生素C的合成，提高维生素C的含量。以下结合具体实施对本专利技术做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的分子生物学实验及条件(如Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laborato ry Press，1989)》中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：锌指蛋白提高植物维生素C含量的机理的发现：专利技术人通过酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶报告系统、蛋白质免疫共沉淀和蛋白质分子杂交试验证明，锌指蛋白SlZF3通过与GDP-D-甘露本文档来自技高网...

【技术保护点】
锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用。

【技术特征摘要】
1.锌指蛋白在提高植物维生素C含量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，所述的锌指蛋白为C2H2类的锌指蛋白。3.根据权利要求1所述的应用，所述的锌指蛋白为番茄锌指蛋白SlZF3，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的应用，所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳波，李营，储转南，卢永恩，叶志彪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42