本发明专利技术公开了一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法。本发明专利技术对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，利用该特异性引物，并运用RT‑PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，经过实验证明，本发明专利技术的方法准确性高，结果可靠，能为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其是一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法。
技术介绍
肌细胞增强因子2B（MEF2B）基因属于肌细胞增强因子2家族（Myocyte-specific enhancer binding factor 2,MEF2）中的一员，研究表明，多种生理过程与MEF2基因家族相关，如骨骼发育、肌肉形成、肝脏纤维化和神经系统发育，MEF2于肌肉细胞中广泛存在，在与大多数肌肉特异基因的启动子或增强子直接结合后，能够启动或增强基因的相关表达，该基因可作为肌源性基因表达的主要调节物。MEF2B基因位于脊椎动物中MEF2家族进化树的基部，距离其它成员最远，因此其缺少HJURP_C区域，仅含有MADS-box结构域。Hidaka等（1995）在研究MEF2B基因与其同源的基因在小鼠胚胎性癌细胞P19(简称EC细胞)差异性表达的时候发现，在P19细胞分化的过程中，MEF2A和MEF2D基因的转录出现上调，而MEF2B基因的转录却大量存在于未分化的P19中，在畸胎瘤细胞（F9细胞)和胚胎干细胞（ES细胞）以及成年小鼠心脏、骨骼肌或脑组织中出现下调，由此说明小鼠的MEF2B基因可能在胚胎发育的过程中与MEF2基因家族的其他成员有着不同的功能。MEF2B基因很有可能替代MEF2C基因的作用，如果在胚胎时期敲出MEF2C基因，MEF2B基因的表达量会显著上升（Lin等，1997）。Ying等（2013）认为MEF2B基因的突变，可导致弥漫性大B细胞淋巴瘤原癌基因BCL6的表达束缚受到抑制。研究指出，MEF2B在多种肌肉及神经组织中高表达，何波（2006）对猪的MEF2B和MEF2C基因的组织表达谱分析发现，两个基因在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪和睾丸等8个组织中均能检测到表达，且表达量都较高，通过对骨骼肌体外培养发现，随着分化程度的深入，它们的表达量也越来越高。祁艳霞等（2013）利用荧光实时定量PCR技术分析了南阳黄牛3月龄到24月龄间背最长肌组织中MyoD和MEF2基因家族的表达变化情况，结果表明MEF2B基因的表达呈持续上升趋势。程波（2012）报道，MEF2B基因在山羊个体的不同组织间均能检测到，但表达量有着不同的规律。上述研究结果提示，鸭MEF2B基因可能与其生产水平、肉质性状等有关联。国内鸭MEF2B基因的相关研究报道，NCBI数据库中暂无鸭MEF2B基因序列及相关的文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法，它准确性高，结果可靠，为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。本专利技术是这样实现的：鸭MEF2B基因的编码序列，它具有如序列表中SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。克隆鸭MEF2B基因CDS区序列的方法，对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA第一条链后，根据同源物种设计特异性引物，F:ATGGGCCGGAAAAAAATCCA，R:CTATCTCTGCCAAACGTCCACGG；运用RT-PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，将RT-PCR扩增产物与pGEM-T载体连接，构建pGEM-T-MEF2B重组质粒，即完成了对鸭MEF2B基因CDS区序列的克隆。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本专利技术对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，利用该特异性引物，并运用RT-PCR方法结合A/T克隆技术对鸭MEF2B基因进行克隆，经过实验证明，本专利技术的方法准确性高，结果可靠，能为构建鸭MEF2B基因的原核、真核表达载体及相关动物模型等研究提供基础材料。附图说明图1为鸭MEF2B基因RT-PCR凝胶电泳检测图；图2为鸭MEF2B基因构建pGEM-T-MEF2B重组质粒PCR凝胶电泳检测图。具体实施方式本专利技术的实施例：用于克隆鸭MEF2B基因编码区序列的引物及方法1、鸭总RNA提取及cDNA的合成采取鸭胸肌组织液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存，用于总RNA抽提，参照TRizol Reagent试剂（life/Invitrogen, USA）说明书进行，将所得总RNA逆转录为cDNA的第一条链，cDNA合成根据Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis (K1622)逆转录试剂盒合成，2、鸭MEF2B基因CDS区序列引物设计欲扩增鸭MEF2B基因CDS区序列由于该基因在鸭物种上NCBI尚未给出，故采用物种同源性的方法采用鸡的MEF2B基因（GenBank：XM_004948890.2）和紫翅椋鸟MEF2B基因（GenBank：XM_014887170.1）mRNA序列运用NCBI中Primer-BLAST在线设计引物进行设计，引物由上海英潍捷基生物有限公司合成，引物具体信息见表1。3、鸭MEF2B基因CDS区RT-PCR扩增反应：反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性40 s，退火35 s（退火温度详见表2-3），72 ℃延伸45 s，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存，32循环。反应体系：采用30 μL反应体系，其中：2×Taq PCR Master Mix (北京天根) 13 μL，上、下游引物各2 μL（浓度均为10 μmol/L），cDNA模板2μL（1550 ng/μL），加RNase-free water补足至30 μL。4、重组质粒的构建及测序鸭MEF2B基因CDS区PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后（图1），采用AXYGEN柱式DNA胶回收试剂盒进行RT-PCR产物切胶回收纯化，纯化产物按照pGEM-T载体试剂盒说明书进行操作，采用蓝白斑法筛选克隆产物，最终提取重组质粒(图2)送往上海英潍捷基生物有限公司测序。5、测序结果验证扩增目的片段（鸭MEF2B基因的编码序列）长度为1221 bp，其具体序列如序列表中SEQ ID NO ：1 所示。其中包含起始密码子ATG和终止密码子TAG，所得片段长度与其他物种MEF2B基因CDS区片段长度相近，经NCBI在线保守结构域预测发现，该序列含有含有MADS-box保守区域，不含HJURP_C区域，符合脊椎动物MEF2B基因结构，说明鸭的MEF2B基因CDS区序列克隆成功。SEQUENCE LISTING序列表<110> 贵州大学<120> 鸭MEF2B基因的编码序列及其克隆方法<130> nm:<160> 3<170> PatentIn version<210> 1<211> 1221<212> DNA<213> 鸭（Anas platyrhynchos）<400> 1ATGGG CCGGA AAAAA ATCCA GATCA GCCGA ATTCT GGACC AGCGG AACCG GCAGG TGACC 60TTCAC CAAGC GTAAA TTCGG GCTGA TGAAG AAGGC GTACG AGCTG AGCGT GCTGT GCG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭MEF2B基因的编码序列，其特征在于：它具有如序列表中SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种鸭MEF2B基因的编码序列，其特征在于：它具有如序列表中SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。2.一种克隆鸭MEF2B基因CDS区序列的方法，其特征在于：对鸭的组织提取总RNA，并将总RNA逆转录为cDNA第一条链后，设计特异性引物，F:ATGGGCCGGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，赵忠海，卜小雁，易恒洁，彭邦星，师新彩，张蓉，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。