本发明专利技术属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由山羊SPARC基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，在序列表SEQ ID NO.1所示的第203‑210位区域存在插入/缺失突变，该突变导致Nar Ⅰ‑RFLP多态性。本发明专利技术还公开了获得分子标记的制备方法及多态性检测方法的应用，为奶山羊的标记辅助选育提供了一个新的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记及其应用
本专利技术属于动物分子标记制备
，具体涉及一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记的制备与应用。
技术介绍
我国是奶山羊饲养量较多、分布范围较广的国家，20世纪60-80年代曾经是我国奶业的主导产业，90年代以后受到饲养规模小、乳品工业迅速膨胀等因素的影响，奶山羊生产发展迟缓。近十多年来，随着人民生活水平的不断提高和膳食结构改善的需求，人们对山羊奶营养价值和安全性的认同度有所改变，尤其是机器挤奶解决了规模化饲养的瓶颈问题，促进了我国奶山羊产业的复兴和发展。我国奶山羊品种是在二十世纪初由国外传教士带入的奶山羊品种与本地山羊杂交改良，又经过生态适应和系统选育而形成的，已经列入国家品种志或名录的有雅安奶山羊、崂山奶山羊、关中奶山羊和西农萨能奶山羊等。但由于饲养分散、规模较小等原因，我国奶山羊的遗传改良主要采用常规的育种手段，其泌乳性能遗传进展较为缓慢。随着分子生物学技术的快速发展，分子标记辅助育种已成为动物遗传育种研究的热点和必然趋势。应用分子技术阐明奶山羊泌乳性状的调控机制，结合泌乳性状加强奶山羊的选育，必将大大加快奶山羊育种的进程。分子标记辅助育种技术的核心是寻找决定泌乳性状的主效基因及其分子标记。近年来，国内外学者对奶山羊产奶性状相关基因进行了一些研究，找到了一些功能基因和分子标记，但是有关乳体细胞数性状的研究报道较少。SPARC基因与细胞生长代谢相关。孙杰(2009)通过差异消减法鉴定到SPARC基因在西农萨能奶山羊泌乳初期和盛期乳腺组织之间存在差异表达，并通过实时荧光定量PCR进行了验证(孙杰，奶山羊乳腺消减文库构建及差异表达基因的研究，石河子大学2009年博士学位论文)，提示该基因可能在奶山羊泌乳过程中发挥重要的调控作用,可作为开发奶山羊分子育种标记的候选基因。本专利技术申请中克隆与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段，并找到一个与奶山羊乳体细胞数性状相关的突变位点，为奶山羊育种提供新的分子标记。
技术实现思路
本专利技术克隆了与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段(该基因片段就是本专利技术制备的与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记)，并提供了与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段的制备方法，该方法通过设计特异性的引物，扩增包括一个突变位点的SPARC基因的部分片段，并且根据NarⅠ-RFLP方法得到的不同酶切图谱确定不同的基因型。本专利技术还提供了一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段在奶山羊分子标记辅助选育中的应用。具体地，本专利技术采用以下技术方案：一、专利技术人通过基因克隆方法得到了一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段(该基因片段就是本专利技术制备的与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记)，其核苷酸序列如下所示：gctttgggaatgagggcgaggctctctgctttgccaacaggtgtgcagcaacgacaacaagaccttcgactcttcctgccacttctttgccaccaagtgcacactggagggcaccaagaagggccacaagctccacctggactacatcgggccttgcaaatgtgagtctccttgggccccgccaagcctcccgtctcagggaagaggcgccaaattggcactgctgctggctctgccacctctgggctgtgtgatcttgggcacctctcttcccctgtctgagcttcagggatcccagttatagaatgagatgattgtttatgagctggtatctgtactcaggacccctccagggaaggactgagcagtggagggaacacaggatcagggcagattt上述序列203-210位区域(带下划线区域，AGAGGCGC)存在插入/缺失突变(即这八个碱基的有或无)，该突变导致NarⅠ-RFLP多态性。二、专利技术人设计了一种检测与奶山羊乳体细胞数性状相关的基因片段突变的引物对，其DNA序列如下所示：正向引物SPARCF6:GCTTTGGGAATGAGGGCGAG反向引物SPARCR6:AAATCTGCCCTGATCCTGTGTT三、一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段的制备方法，其步骤是：1、引物设计利用引物设计软件以山羊SPARC基因序列为模板设计出包含部分序列的扩增引物对SPARCF6、SPARCR6，其DNA序列如SEQIDNO.2-3所示：SPARCF6:GCTTTGGGAATGAGGGCGAGSPARCR6:AAATCTGCCCTGATCCTGTGTT2、PCR产物的纯化和测序构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板，利用步骤1所得引物进行PCR扩增，所得PCR产物测序，测序序列与山羊SPARC基因比对，获得与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记，其DNA序列如SEQIDNO.1所示，具体地：在崂山奶山羊群体中随机选取2个及以上个体的基因组DNA，等量混合，以此为模板进行PCR扩增，将所得PCR产物送公司测序。测序序列与山羊SPARC基因比对，成功获得山羊SPARC基因部分序列397bp/389bp的片段，序列如下：gctttgggaatgagggcgaggctctctgctttgccaacaggtgtgcagcaacgacaacaagaccttcgactcttcctgccacttctttgccaccaagtgcacactggagggcaccaagaagggccacaagctccacctggactacatcgggccttgcaaatgtgagtctccttgggccccgccaagcctcccgtctcagggaagaggcgccaaattggcactgctgctggctctgccacctctgggctgtgtgatcttgggcacctctcttcccctgtctgagcttcagggatcccagttatagaatgagatgattgtttatgagctggtatctgtactcaggacccctccagggaaggactgagcagtggagggaacacaggatcagggcagattt上述序列203-210位(带下划线区域)共8个碱基(AGAGGCGC)出现插入/缺失突变(I/D)，该突变导致NarⅠ-RFLP多态性。经NarⅠ酶切后产生389bp、208bp和189bp三条带(其中208bp和189bp两条带大小接近，显示为一条带)，说明该个体SPARC两个等位基因203-210位突变区域分别为插入(I)和缺失(D)，判定为ID基因型；经NarⅠ酶切后产生389bp一条带(未切开)，说明该个体SPARC两个等位基因203-210位突变区域均为缺失(D)，判定为DD基因型。四、一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的SPARC基因片段在奶山羊分子标记辅助选育中的应用选取处于泌乳期的崂山奶山羊种母羊200只，采取颈静脉全血，提取基因组DNA，使用引物对SPARCF6、SPARCR6，对奶山羊群体DNA进行PCR扩增，使用NarⅠ酶切检测每个个体的基因型，发现ID型的乳体细胞数性状显著优于DD型(P<0.05)，选择ID型个体留种。五、本专利技术制备的引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：
【技术特征摘要】
1.一种与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：上述序列203-210位区域存在插入/缺失突变，该突变导致NarⅠ-RFLP多态性。2.一种检测与奶山羊乳体细胞数性状相关的基因片段突变的引物对，其特征在于，其DNA序列如下所示：正向引物SPARCF6:GCTTTGGGAATGAGGGCGAG反向引物SPARCR6:AAATCTGCCCTGATCCTGTGTT。3.权利要求1所述的与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以山羊SPARC基因序列为模板，设计引物对SPARCF6、SPARCR6，其DNA序列如SEQIDNO.2-3所示；S2.构建PCR反应体系，以奶山羊基因组DNA为模板利用S1所得引物进行PCR扩增；S3.步骤S2所得PCR产物测序，测序序列与山羊SPARC基因比对，获得与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求3所述的与奶山羊乳体细胞数性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR反应体系为：1μL的50ng/μL的奶山羊外周血基因组DNA，12.5μL的2×PCRMix，0.75μL10mM的正向引物SPA...
【专利技术属性】
技术研发人员：李和刚，程明，宋晓娜，杨峰，包汉勋，郝小静，张宝珣，李培培，杨培培，刘开东，苗刚，张明，郭成玉，
申请(专利权)人：青岛市畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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