一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。本发明专利技术提供的重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA是将CHO-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；CHO-K1-EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO-K1细胞；产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有DNA分子甲的重组表达载体甲；DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子；产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有DNA分子乙的重组表达载体乙；DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。本发明专利技术对于癌症的治疗具有重大的应用价值。

Recombinant cell and application thereof in preparing medicament for treating human epidermal growth factor receptor

The present invention discloses one kind of recombinant cell and its application in preparing medicine for treating human epidermal growth factor receptor. Recombinant CHO-K1-EGFR-7gRNA cells provided by the invention is DNA sequence sequence list of the genome of CHO-K1-EGFR cells in 6 shown recombinant cells were obtained for DNA substituted molecular sequences shown in Table 7; preparation method is as follows: CHO-K1-EGFR cells a and B are common products into CHO-K1 cells; a product as follows (a) or (b) a:DNA molecule; (b) DNA containing a recombinant molecule expression vector; DNA molecule DNA as a light chain L4 sequence encoding sequence table 1 shows the products as follows; B (c) or (d):DNA (b) containing DNA B; molecular B recombinant expression vector B; DNA molecular H3 heavy chain sequence encoding DNA molecule B sequence table 3 shows the. The invention has great application value for the treatment of cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。
技术介绍
近年来，治疗性抗体在临床上的应用越来越广泛。2000-2010年，抗体药物在全球生物制药中所占份额从10.5％扩张到56.41％，预计2015年全球抗体药物市场规模有望达到680亿美元。抗体恒定区缺少核心岩藻糖基化的治疗性抗体目前正处于临床研究中，它们在体外和体内都可以促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibodydependentcellularcytotoxicity,ADCC),这种生理活性引起人们广泛关注，并成为此类药物研究的热点之一。近年出现多种基因组编辑技术，主要有：锌脂核酸酶技术(zincfingernuclease,ZFNs)、转录激活样效应核酸酶技术(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)与RNA导向的CRISPR-Cas9核酸酶系统。CRISPR-Cas9核酸酶系统是近年来发现并被广泛应用于真核细胞基因组编辑的一种技术。该技术利用Cas9切割靶序列形成双链断裂(DSB)，随后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进而达到对靶基因序列编辑的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株重组细胞及其在制备抗人表皮生长因子受体治疗药物中的应用。本专利技术首先保护一株重组细胞，即重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA。重组细胞r>CHO-K1-EGFR-7gRNA是将CHO-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；所述CHO-K1-EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO-K1细胞，得到CHO-K1-EGFR细胞；所述产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子。所述DNA分子甲具体可为序列表的序列2所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的DNA分子或序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子。所述重组表达载体甲具体可为在pcDNA-3.3载体的多克隆位点(例如HindⅢ和NotI酶切位点之间)插入所述DNA分子甲得到的重组质粒。所述产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重组表达载体乙；所述DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。所述DNA分子乙具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。所述重组表达载体乙具体可为在pOptiVEC载体的多克隆位点(例如HindⅢ和NotI酶切位点之间)插入所述DNA分子乙得到的重组质粒。以上任一所述重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA分泌的抗体(IgG)也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护所述抗体在制备用于杀伤肿瘤细胞的药物中的应用。所述肿瘤细胞可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。本专利技术还保护一种用于杀伤肿瘤细胞的药物，其活性成分为所述抗体。所述肿瘤细胞可为表皮癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A431细胞。本专利技术还保护所述抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。所述癌症可为表皮癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。本专利技术还保护一种用于治疗癌症的药物，其活性成分为所述抗体。所述癌症可为表皮癌。所述癌症具体可为A431细胞引起的表皮癌。本专利技术对于癌症的治疗具有重大的应用价值。附图说明图1为7种gRNA在Fut8中靶标位置。图2为WesternBlot的结果。图3为错配酶T7E1检测切割效率的结果。图4为细胞生长情况检测的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pSpCas9(BB)-2A-Puro载体：购自addgene，目录号PX459。CHO-K1细胞：ATCC，CCL-61。CDCHOMedium：Gibco产品，目录号10743-029。OptiMEMIMedium：Gibco产品，目录号31985-070。脂质体(FugeneHD)：购于Promega公司，目录号E2311。嘌呤霉素：购于GeneOperation公司，目录号ISY1130-0025MG。西妥昔单抗(溶液形式：100mg/50ml，无色透明液体，IgG抗体):德国Merck公司，进口药品证号：S20050095，产品批号7667201。A431细胞(人表皮癌细胞)：ATCC，CRL-1555。pcDNA-3.3载体：Invitrogen公司，目录号K8300-01。pOptiVEC载体：Invitrogen公司，目录号12744-017。轻链L4的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示。重链H3由重链可变区(VH)、重链恒定区1(CH1)、铰链区、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)组成(H3＝VH+CH1+hinge+CH2+CH3)。重链H3的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1-145位氨基酸为重链可变区(VH)，第146-243位氨基酸为重链恒定区1(CH1)，第244-258位氨基酸为铰链区(hinge)，第259-369位氨基酸为重链恒定区2(CH2)，第370-475位氨基酸为重链恒定区3(CH3)。实施例1、CHO-K1-EGFR细胞的制备CHO-K1-EGFR细胞即表达抗EGFR人源化抗体L4H3的CHO-K1细胞，其构建过程如下：1、将序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的双链DNA分子插入pcDNA-3.3载体的HindⅢ和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA-3.3-L4。2、将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pOptiVEC载体的HindⅢ和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pOptiVEC-H3。3、将重组质粒pcDNA-3.3-L4和重组质粒pOptiVEC-H3通过共转染的方式共同导入CHO-K1细胞，得到重组细胞，将其命名为CHO-K1-EGFR细胞。实施例2、重组细胞的发现一、RNA的设计C本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组细胞CHO‑K1‑EGFR‑7gRNA，是将CHO‑K1‑EGFR细胞的基因组中序列表的序列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；所述CHO‑K1‑EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO‑K1细胞，得到CHO‑K1‑EGFR细胞；所述产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA分子；所述产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重组表达载体乙；所述DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，是将CHO-K1-EGFR细胞的基因组中序列表的序
列6所示的DNA分子取代为序列表的序列7所示的DNA分子得到的重组细胞；
所述CHO-K1-EGFR细胞的制备方法如下：将产品甲和产品乙共同导入CHO-K1细胞，
得到CHO-K1-EGFR细胞；所述产品甲为如下(a)或(b)：DNA分子甲；(b)含有所述DNA
分子甲的重组表达载体甲；所述DNA分子甲为编码序列表的序列1所示的轻链L4的DNA
分子；所述产品乙为如下(c)或(d)：DNA分子乙；(b)含有所述DNA分子乙的重组表
达载体乙；所述DNA分子乙为编码序列表的序列3所示的重链H3的DNA分子。
2.如权利要求1所述的重组细胞CHO-K1-EGFR-7gRNA，其特征在于：
所述DNA分子甲为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2自5’末端第85-726位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2自5’末端第9-729位核苷酸所示的DNA分子；
(f3)序列表的序列2所示的DNA分子；

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·威孚，王淑敏，朱林，靳彦文，曹诚，张部昌，汪苏曼，于庆卓，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34