本发明专利技术是一个新的棉纤维特异表达基因GhDUF231L1全长序列，其功能涉及棉花纤维次生壁物质的形成与修饰。GhDUF231L1基因包括5个外显子和4个内含子，以及1.6kb启动子片段，编码430氨基酸。该基因是一个棉纤维次生壁发育特异性基因，其表达量在开花后15天的纤维中急剧增加，至开花后20天时其表达量达到峰值。GhDUF231L1启动子主要在转基因拟南芥叶片的叶脉和茎的维管系统中表达，在根、花及荚果中也有表达。该启动子区域含有能够与上游转录因子发生结合的顺式作用元件。在拟南芥中过量表达GhDUF231L1，导致转基因植株增大，纤维素含量升高，细胞壁单糖组分含量发生改变。以上这些结果表明GhDUF231L1参与植物发育，特别是次生细胞壁的生物合成，可能在棉纤维发育过程中起关键作用。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及棉花基因。具体是一个棉纤维特异表达的DUF231家族基因 GhDUF231Ll及其启动子的克隆与功能鉴定。
技术介绍
： 棉纤维是已知的纤维素纯度最高的天然资源之一，在世界纺织业中占有重要地 位。虽然合成纤维的出现曾使棉纤维的市场占有率大幅下降，但棉纤维终因有着良好的透 气性、保暖性和吸湿性以及穿着舒适等优点而不可取代。随着高效、快速的纺纱技术的引 入，以及人们保健意识的增强和生活水平的提高，对棉纤维品质的要求愈加迫切。纤维强度 是原棉品质的重要指标，棉纤维次生壁加厚期是棉纤维强度形成的关键时期，纤维素的累 积速率决定了棉纤维的结构和强度。 棉花改良的目标是提高棉花产量和品质，利用基因工程培育优质棉品种，是适应 我国现代农业生产，满足人们对棉纺织品不同需求的有效途径之一。虽然传统棉花育种技 术对于我国棉花生产的发展起着重要的作用，但其方法局限于品种间的基因重组，不仅育 种周期长，而且难以解决遗传连锁、多基因性状和杂交不亲和性等问题。现代基因工程技术 可以将优良外源基因导入并整合到棉花基因组中，使棉花获得自身不具备的新性状，并在 其后代植株中得以遗传和表达。这样不仅可以突破物种间的遗传障碍，大跨度地超越物种 间的不亲和性，而且可以创造出人们所需要的新品种，因而大大拓宽了棉花遗传改良的途 径。棉花纤维品质除了受环境因素影响外，主要由棉花基因型决定。棉花纤维发育相关基 因的克隆鉴定，不仅有助于研宄揭示棉花纤维细胞发育及纤维素合成的分子机理，而且可 以充分利用棉花自身资源改良纤维品质，具有重要的理论意义和巨大的潜在经济价值。 DUF231家族基因编码了 一类含有未知功能结构域（domainofunknown function，DUF)的蛋白。通常情况下，该类基因还含有一个植物特有的保守 的TBL(trichomebirefringencelike)结构域，在该结构域中有一个典型的 ⑶S(glycine-aspartate-serine)基序。研宄证明，这种保守性存在于一些醋化酶/脂酶当 中（Akohetal.，2004;Uptonetal.，1995)。另外，在该类蛋白C端的DUF231结构域中含 有一个高度保守的氨基酸序列DCXHWCLPGXXDXWN，其中的DCXH基序与⑶S基序中的丝氨酸 残基一起形成一个具有催化功能的结构（Bischoffetal.，2010 ;M?lgaardetal.，2004)。 目前，在拟南芥中共发现46个该基因家族成员，其中，TBR(trichome birefringence)与它的同源基因TBL3能够与纤维素合成酶基因CESA(cellulose synthase)共表达。抑制拟南芥TBR或TBL3的表达导致表皮毛和茎的次生细胞壁中的结晶 纤维素含量下降，下胚轴中果胶甲基酯化酶活性升高，果胶甲基酯化程度降低，说明DUF231 蛋白可能参与维持拟南芥某些组织器官细胞壁中果胶（尤其是同型半乳糖醛酸聚糖）的 酯化过程中，而这个过程则保证了次生壁中纤维素的正常合成（Bischoffetal.，2010)。 AXY4和其同源基因AXY4L同属于DUF231家族成员，敲除拟南芥中的AXY4,导致植株除了种 子之外，其它组织器官细胞壁中的木葡聚糖完全缺失0-乙酰化修饰，而种子中木葡聚糖的 乙酰化修饰则完全由其同源基因AXY4L来控制。AXY4可能是一种多糖特异性（尤其是木葡 聚糖特异性）的〇-乙酰基转移酶。虽然这种酰基转移酶的活性以及酰基转移的位置目前 还不清楚，但过量表达AXY4不仅增加了木葡聚糖的乙酰化程度，而且能够使木葡聚糖中的 半乳糖残基发生双乙酰化现象，说明AXY4能够将多个乙酰基团加到同一个半乳糖残基上。 另外，AXY4将乙酰基团加在一个特定的位置，而该位置上的乙酰基团则能够通过化学位移 移至其它位置，从而将这个0-乙酰化的初始位点空出，以备后续乙酰化的进行（Gilleet al.，2011)。ESK1 (Eskimol)是DUF231家族的又一成员，定位于木聚糖的合成场所一高尔基 体中。eskl突变体中，次生壁厚度变薄，茎的支撑力减弱。化学方法分析该突变体的细胞壁 组分发现，虽然ESK1的突变并未引起木聚糖链长度以及还原端丰度的变化，但是却使得木 聚糖的乙酰化程度明显下降。进一步对木聚糖的结构进行分析发现，ESK1的突变导致木聚 糖中的木糖残基上2-0-和3-0-乙酰化程度的降低（Yuanetal.，2013)。另外，全基因组 的基因表达比对显示，ESK1表达量的改变导致冷信号途径中的转录因子以及应答基因的转 录水平也随之发生变化，而且eskl突变体增强了拟南芥植株对冷胁迫的耐受，说明ESK1在 拟南芥应对冷胁迫的过程中发挥着调节因子的作用（Xinetal.，2007)。上述研宄表明，目 前拟南芥中已知的DUF231家族成员均参与到了次生壁物质的合成与修饰过程当中，而大 量该家族成员的功能还有待挖掘。特别是该类基因如何参与棉纤维发育的调控，值得研宄 探讨，以揭示该类基因的生物学功能，为棉纤维品质改良提供科学依据。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于提供一个新的棉纤维次生壁发育阶段优势表达的DUF231基因 GhDUF231Ll及其启动子，分析揭示该基因功能和启动子活性，探索其对棉纤维发育调控的 分子机制，进而应用该基因改良棉纤维品质，创造棉花优良品种。 提取棉花基因组DNA，利用PCR和基因组步移法（TakaraGenomeWalkingKit)分 离克隆了GhDUF231Ll基因及其5' -上游区。序列分析表明，该基因5' -上游区是1. 6kb 的启动子序列，编码区（0RF)由5个外显子组成，其间插入了 4个内含子。其中，第一个内 含子长97bp，插入第146位氨基酸密码子内；第二个内含子长131bp，插入第236位氨基酸 密码子内；第三个内含子长94bp，插入第345位氨基酸密码子内；第四个内含子长85bp，插 入第429与430位氨基酸密码子之间。 由于GhDUF231Ll基因在开花后20天（20DPA)的棉纤维中高量表达，因此，我们提 取了 20DPA棉纤维的RNA，反转录成cDNA，继而以20DPA棉纤维cDNA为模板，利用PCR技术 分离鉴定了GhDUF231Ll的cDNA全长序列。GhDUF231Ll的cDNA包含了一个1293bp的开放 阅读框，编码一个含有430氨基酸的蛋白质。该蛋白的N端包含一个跨膜结构域和TBL结 构域，而C端则含有一个典型的DUF231结构域。通过同源进化分析发现，该蛋白与拟南芥 TBL3同源性较高。已有研宄表明，AtTBL3能够调控拟南芥果胶甲基酯化酶的活性，进而影 响次生细胞壁中纤维素的含量，这暗示GhDUF231Ll可能在棉纤维中发挥着类似的功能。 对GhDUF231Ll在棉花组织中的表达情况进行了分析，发现该基因在棉纤维细 胞发育早期（1 _ 12DPA)仅有弱的表达，随着纤维细胞进一步发育至次生壁合成期（15 -20DPA)，该基因表达量急剧升高，至20DPA时达到峰值。在棉花其他组织中，该基因不表达 或仅有微弱表达。 构建GhDUF231Ll启动子：⑶S基因表达载体，利用⑶S报告基本文档来自技高网...
【技术保护点】
棉花GhDUF231L1基因，其特征在于：DNA序列如下：从1–1623bp为启动子序列(5’‑上游区)；起始密码子ATG位于第1624–1626bp，第1624–2060bp为第一个外显子区，第2061‑2157bp为第一个内含子区，用下划线标出，第2158‑2329bp为第二个外显子区，第2330‑2460bp为第二个内含子区，用下划线标出，第2461‑2657bp为第三个外显子区，第2658‑2751bp为第三个内含子区，用下划线标出，第2752‑2910bp为第四个外显子区，第2911‑2995bp为第四个内含子区，用下划线标出，第2996‑3323bp为第五个外显子区，其末尾3个碱基TAA为终止密码子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李学宝，张杰，邹丹，鄢静秋，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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