本发明专利技术公开了一种人工猪表皮生长因子真核表达载体及其制备方法和其酿酒酵母工程菌。根据酿酒酵母对猪表皮生长因子密码子的偏好性人工合成了猪表皮生长因子基因，其基因如序列表SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术还提供了含有该基因的酿酒酵母表达载体及其具有分泌表达的工程菌，并提供了获得该工程菌的方法。本发明专利技术人工猪表皮生长因子基因具有酿酒酵母偏爱型特点，其工程菌含有酿酒酵母信号肽以利于猪表皮生长因子的分泌表达，该工程菌在表达猪表皮生长因子过程中不用甲醇诱导而用可作为饲料的棉子糖，不需纯化提取，可将工程菌和表迖产物直接作为饲料，大大降低了猪表皮生长因子作为饲料的成本和生产周期，为猪表皮生长因子在饲料工业中的应用提供了可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种人工猪表皮生长因子真核表达载体及其制备方法和其酿酒酵母工程菌。
技术介绍
猪表皮生长因子(Porcine epidermal growth factor, pEGF)是猪初乳中相对含量较高的一种生长因子，是一种强有力的细胞有丝分裂原，具有刺激细胞分裂、增殖与分·化、促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性，它对断奶仔猪胃肠道的发育有非常重要的影响。由于断奶使得乳源性表皮生长因子突然中断，仔猪的消化系统还未发育完全，抵抗力较弱，断奶仔猪的胃肠黏膜难以适应饲料，而引发断奶应激，采食量、日增重及饲料转化率大幅度降低，导致仔猪容易腹泻、免疫力下降、多病、生长缓慢、死亡率高。据相关文献报道猪表皮生长因子PEGF有利于猪早期胚胎发育、能提高母猪的窝产仔数、提高仔猪成活率以及促进断奶仔猪的生长。基于猪表皮生长因子所具有的多种功能和重要作用，Pascall等(1991)在酿酒酵母中表达了少量的PEGF融合蛋白；2001年，美国专利报道了在大肠杆菌中融合表达pEGF ；杨桂香等(2006)做过猪表皮生长因子在大肠杆菌中的GST-pEGF融合表达；汪洋等(2007)在毕赤酵母中表达了 6His-pEGF融合蛋白。以上研究都需要将表达产物进行纯化，然后才能利用，因而成本高。2005年，中国台湾有人做过猪表皮生长因子在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,用发酵上清液做饲喂动物实验,但其中含甲醇,作饲料前需要去除对动物有害的甲醇。中国专利200610114038. 7公开的猪表皮生长因子在毕赤酵母中表达也要用甲醇诱导，所以这样表达产物中尽管有猪表皮生长因子，但不能直接用于作饲料，需要提纯后才能利用。由于去除甲醇和提纯的成本高，所以用毕赤酵母表达猪表皮生长因子较难用作饲料推广。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种适于酿酒酵母表达的人工猪表皮生长因子基因。本专利技术根据猪表皮生长因子的氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏好性，设计编码与猪表皮生长因子氨基酸序列相同的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本专利技术的第二个目的提供一种人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2_MFa -(S)pEGF，其特征在于，在酿酒酵母信号肽Mf α核苷酸序列的3’端接上人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O中，所述的酿酒酵母信号肽Mf a核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。优选插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O的酶切位点Kpn I和Xba I之间，用插入片段替换酶切位点Kpn I和Xba I之间的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述人工猪表皮生长因子真核表达载体PYES2-MF a - (S) pEGF的酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I。本专利技术的第四个目的是提供人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MF Q-(S)pEGF的构建方法，其特征在于，首先在酿酒酵母信号肽Mf α的核苷酸序列的3’端接上人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O中，所述的酿酒酵母信号肽Mfa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。优选插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O的酶切位点Kpn I和Xba I之间，用插入片段替换酶切位点Kpn I和Xba I之间的核苷酸序列。具体构建方法为a.将如SEQ ID NO.1所示的人工猪表皮生长因子(S) pEGF基因的核苷酸序列插入 PMD18-T Simple Vector的BamH I酶切位点和Xba I酶切位点之间，其5’端接BamHI酶切位点，3’端接Xba I酶切位点，由此得到质粒pMD18-T-(S)pEGF ；b.将如SEQ ID NO. 2所示的酿酒酵母信号肽MFa的核苷酸序列连接到质粒pMD18-TSimple Vector 上，构建成重组质粒 pMD18_T_MF α ；c.将重组质粒pMD18-T_Mf α和酿酒酵母表达质粒PYES2. O用内切酶Kpn I和内切酶BamH I分别对其进行双酶切，然后用T4DNA连接酶将酿酒酵母信号肽MF α的核苷酸序列与酿酒酵母表达质粒PYES2. O连接构建成重组质粒pYES2-Mf α ；d.用内切酶BamH I和内切酶Xba I分别对重组质粒pYES2_Mf α和质粒pMD18-T-(S)pEGF进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶将人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因插入重组质粒pYES2_Mf α中构建成人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFa-(S)pEGFo将构建好的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MF a -(S)pEGF按照常规的转化方法，如醋酸锂法转化到酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I中，即得到人工猪表皮生长因子酿酒酵母工程菌。本专利技术通过构建酿酒酵母偏爱型的人工猪表皮生长因子基因，再在其前端加上酿酒酵母信号肽Mf α的核苷酸序列，以利于作为饲料在胃肠中吸收利用，再插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O中，然后转化进入酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I，而得到含人工猪表皮生长因子基因的酿酒酵母工程菌，该工程菌在表达猪表皮生长因子过程中不用甲醇诱导，只需用可作为饲料的棉子糖诱导即可，半乳糖不能诱导，从而使工程菌和表迖产物能不需脱毒、纯化，而直接作为饲料，大大降低了工程菌和表迖产物作为饲料的成本和生产周期，还减少了脱毒设备的投资，为本专利技术人工猪表皮生长因子基因在饲料工作中应用提供了优选技术方案。本专利技术还具有重组菌株易培养，猪表皮生长因子表达量高，用作饲料无需纯化,生产成本低等特点。附图说明图1是酿酒酵母分泌信号肽基因Mf α的PCR产物电泳图，图中I是酿酒酵母分泌信号肽基因PCR产物，M是DNA分子量标准；图2是重组质粒pYES2_MFa -(S)pEGF的双酶切鉴定图，图中I是经Kpn I和XbaI双酶切的pYES2-MF α -(S)pEGF，图中M是DNA分子量标准；图3是酿酒酵母分泌表达载体pYES2-Mfa- (S) pEGF构建的流程图；图4是诱导表达的人工猪表皮生长因子基因的上清液Tricine-SDS-PAGE电泳图，图中M是DNA分子标记，I是经棉籽糖诱导96h的pYES2. 0/INVScl的浓缩上清液，2是经棉籽糖诱导96h的pYES2-MFa -(S)pEGF/INVScl的浓缩上清液。具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不能用来限制本专利技术的范围。实施例1 :酿酒酵母分泌表达载体pYES2-Mfa_ (S) pEGF的构建( I)猪表皮生长因子基因的人工合成根据猪表皮生长因子的氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型人工猪表皮生长因子(S) pEGF基因，其核苷酸序列如下AAT TCT TAT TCT GAA TGT CCA CCA TCT CAT GAT GGT TAT TGT TTG CAT GGTGGTGTT TGT ATG TAT ATT GAA GCT GTT GAT TCT TAT GCT TGT AAT TGT GTT TTTGGT TAT GT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种人工猪表皮生长因子(S) PEGF基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.—种人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFa -(S)pEGF，其特征在于，在酿酒酵母信号肽Mf a核苷酸序列的3’端接上权利要求1所述的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒PYES2. O中，所述的酿酒酵母信号肽Mf a核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3.根据权利要求2所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MFa-(S)pEGF，其特征在于，所述的将其插入酿酒酵母表达质粒PYES2. O中是将其插入酿酒酵母表达质粒PYES2.0的酶切位点Kpn I和Xba I之间，用插入片段替换酶切位点Kpn I和Xba I之间的核苷酸序列。4.一种含有权利要求2或3所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体PYES2-MF α - (S) pEGF的酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I。5.一种权利要求2所述的人工猪表皮生长因子真核表达载体pYES2-MF a -(S)pEGF的构建方法，其特征在于，首先在酿酒酵母信号肽Mfa的核苷酸序列的3’端接上权利要求1所述的人工猪表皮生长因子(S)pEGF基因，然后将其插入酿酒酵母表达质粒pYES2. O中，所述的酿酒酵母信号肽Mfa的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的将其插入酿酒...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭春华，张兴友，陈友慷，周琳，
申请(专利权)人：深圳比利美英伟营养饲料有限公司，郭春华，
类型：发明
国别省市：
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