重组人血白蛋白及其表达载体的构建方法技术

本发明专利技术提供重组人血白蛋白，所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本发明专利技术还提供一种重组人血白蛋白表达载体的构建方法，应用该方法制备得到的重组人血白蛋白表达载体能够分泌人血白蛋白。将该表达载体进行优化后，HSA表达量达150‑180mg/L。

Recombinant Human Albumin and its expression vector construction method

The present invention provides a recombinant amino acid sequence of the recombinant Human Albumin, Human Albumin for ID No.2 sequence table SEQ. The invention also provides a method for constructing the recombinant Human Albumin expression vector. The recombinant Human Albumin expression vector prepared by the method can secrete Human Albumin. The optimized expression vector, the expression of HSA 150 180mg/L.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组人血白蛋白及其表达载体的构建方法。
技术介绍
人血白蛋白（HSA）是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%，在体内起着维持血浆胶体渗透压、运输营养等重要作用。人血白蛋白临床上主要用于失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；在心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗及成人呼吸窘迫综合征中也有广泛应用，是医院临床急救或重症手术的必备药品，在医院市场一直占据举足轻重的地位。人血白蛋白通常由血浆提取。由于浆站改制及血液制品安全监管力度的加强等诸多因素的影响，国内市场以人血白蛋白为代表的血液制品供应严重短缺，供需矛盾问题突出。采用基因工程方法生产重组人血白蛋白具有原料来源丰富、质量可控、可形成规模化生产等优点，同时可以彻底消除病毒污染危险，对于缓解国内人血白蛋白供不应求的局面、消除血源产品的安全风险具有十分重要的社会意义和经济意义，具有广阔的发展空间和市场前景。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了重组人血白蛋白及其表达载体的构建方法，该表达载体能够分泌表达重组人血白蛋白。本专利技术提供重组人血白蛋白，所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本专利技术还提供一种重组人血白蛋白表达载体的构建方法，步骤如下：（1）对人血白蛋白序列进行优化，上游插入Kpn I酶切位点，下游插入Xho I酶切位点，并在Kpn I酶切位点后加入Kozak序列，目的基因全长1845bp，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；（2）进行PCR扩增，之后与pUC57载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，诱导表达后，得到质粒pUC57-HSA；（3）用Kpn I+Xho I分别双酶切pUC57-HSA质粒和pcDNA3.1载体片段并连接，将连接产物转化BL21感受态细胞，诱导表达后提取质粒，得到pcDNA3.1-HSA；（4）利用脂质体转染或电转染将pcDNA3.1-HSA质粒转染CHO-K1-S2细胞。本专利技术还提供应用权利要求2的方法制备得到的重组人血白蛋白表达载体分泌人血白蛋白。本专利技术还提供一种分泌表达人血白蛋白的方法，是将权利要求2制备得到的重组人血白蛋白表达载体接种至培养液中，在一定条件下进行培养。作为优选，是将权利要求2制备得到的重组人血白蛋白表达载体用G418进行持续的筛选和细胞传代，提高细胞活力至85%后，进行单克隆，选择人血白蛋白表达量最佳的细胞株，将该细胞株接种至培养液中，在一定条件下进行培养。作为优选，是将中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1-S2-HSA CCTCC C2015171接种至培养液中，在一定条件下进行培养。作为优选，所述培养液为：Hyclone 公司的SFM4CHO培养基。作为优选，所述在一定条件下培养是于37±1℃、50mL/L CO2、120±30rmp条件下培养3-6天后，再于32±2℃、50mL/L CO2、120±20rmp继续培养。作为更优选，是将CHO-K1-S2-HSA CCTCC C2015171以5×105cells/mL的细胞量接种，培养基为Hyclone 公司的SFM4CHO培养基，于37℃、50mL/L CO2、120rmp培养5天后，添加培养基，然后再于32℃、50mL/L CO2、120rmp继续培养6天。作为优选，所述在一定条件下培养是将CHO-K1-S2-HSA CCTCC C2015171以5×105cells/mL～8×105cells/mL的细胞量接种，培养基为Hyclone 公司的SFM4CHO培养基，培养条件为溶氧量50%、pH7.2及转速100rpm，培养温度为37±1℃，采用流加的方式进行培养。本专利技术的重组人血白蛋白表达载体能够分泌表达重组人血白蛋白，将该表达载体进行优化后，HSA表达量达150-180mg/L。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为重组质粒pcDNA3.1-HSA的酶切结果；图2为重组质粒pcDNA3.1-HSA转染CHO-K1-SFS细胞后的Western blot检测结果，其中，M为Marker，1为转染后24h上清，2为转染后48h上清；图3为HSA标准曲线；图4 为CHO-K1-S2-HSA细胞的冻存与复苏分析，其中1为CHO-K1-S2-HSA复苏后第3代；2为CHO-K1-S2-HSA复苏后第4代；3为CHO-K1-S2-HSA复苏后第5代；4为CHO-K1-S2-HSA冻存前；5为HSA标准品（Sigma）100μg/mL，M为Marker；图5 为CHO-K1-S2-HSA细胞在传代过程中白蛋白含量检测结果；其中1为CHO-K1-S2-HSA 第14代；2为CHO-K1-S2-HSA 第13代；3为CHO-K1-S2-HSA 第12代；4为CHO-K1-S2-HSA 第10代；5为CHO-K1-S2-HSA 第5代；6为CHO-K1-S2-HSA 第0代；7为HSA标准品（Sigma）10μg/ml变性样品；8为HSA标准品（Sigma）10μg/ml非变性样品；M为Marker；图6为CHO-K1-S2-HSA细胞加与不加G418时，上清中的白蛋白含量分析；其中M为Marker；1为CHO-K1-S2-HSA 加G418第1代；2为CHO-K1-S2-HSA 无G418第1代；3为CHO-K1-S2-HSA 加G418第2代；4为CHO-K1-S2-HSA 无G418第2代；5为CHO-K1-S2-HSA 加G418第3代；6为CHO-K1-S2-HSA 无G418第3代；7为CHO-K1-S2-HSA 加G418第5代；8为CHO-K1-S2-HSA 无G418第5代；图7为CHO-K1-S2-HSA细胞上清冻干后的白蛋白检测，其中M为Marker；1为冻干1mg/mL；2为冻干10mg/mL；3为冻干100mg/mL；4为冻干500mg/mL；图8为CHO-K1-S2-HSA细胞的生长曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1一、人血白蛋白哺乳动物真核表达载体的构建1、人血白蛋白(HSA)基因的获得在GENBANK、GOOGLE学术等查询有关HSA相关信息及文献资料，HSA 基因登录号：NM_000477.5。前原白蛋白共609个氨基酸，登录号为NP_000468.1，其中前24个编码信号肽（引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链（长度5-30个氨基酸）。2、重组表达载体pcDNA3.1-HSA的构建根据哺乳动物细胞密码子偏好性，主要针对CHO细胞进行密码子优化，上游插入Kpn I酶切位点，下游插入Xho I酶切位点，并在Kpn I酶切位点后加入Kozak序列，目的基因全长1845bp，由上海生工生物技术有限公司合成。合成的具体核苷酸序列如下：GGTACCGCCACCATGAAGTGGGTCACCTTTATCTCTCTCCTGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人血白蛋白，其特征在于：所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.重组人血白蛋白，其特征在于：所述重组人血白蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。2.一种重组人血白蛋白表达载体的构建方法，其特征在于：步骤如下：（1）对人血白蛋白序列进行优化，上游插入Kpn I酶切位点，下游插入Xho I酶切位点，并在Kpn I酶切位点后加入Kozak序列，目的基因全长1845bp，核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；（2）进行PCR扩增，之后与pUC57载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，诱导表达后，得到质粒pUC57-HSA；（3）用Kpn I+Xho I分别双酶切pUC57-HSA质粒和pcDNA3.1载体片段并连接，将连接产物转化BL21感受态细胞，诱导表达后提取质粒，得到pcDNA3.1-HSA；（4）利用脂质体转染或电转染将pcDNA3.1-HSA质粒转染CHO-K1-S2细胞。3.应用权利要求2的方法制备得到的重组人血白蛋白表达载体分泌人血白蛋白。4.一种分泌表达人血白蛋白的方法，其特征在于：是将权利要求2制备得到的重组人血白蛋白表达载体接种至培养液中，在一定条件下进行培养。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：是...

【专利技术属性】
技术研发人员：马忠仁，李向茸，冯若飞，张海霞，李明生，乔自林，包晓婧，马玉梅，令瑛，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62