一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及构建的菌株与应用技术

本发明专利技术公开了一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法，步骤如下：首先构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。本发明专利技术采用超表达技术，通过高表达内源性溶菌酶基因，改善工业菌株的细胞通透性，增强营养物质的摄取和次级代谢产物的分泌效率，最终提高了代谢产物的表达水平。本发明专利技术首次提出将该菌株的构建方法应用于工业微生物的菌种改造，为微生物育种提供了一条全新的方法。

Construction method of strain for overexpression of endogenous lysozyme and strain and application thereof

The invention discloses a construction method, a super expression of endogenous lysozyme strain steps are as follows: firstly construct the expression vector of endogenous lysozyme, then the expression vector by conjugation into the starting strains, screening of gene engineering bacteria obtained over expression of endogenous lysozyme. The invention adopts ultra high expression technology, through the endogenous expression of lysozyme gene, improve industrial strain cell permeability, enhance the efficiency of nutrient uptake and secretion of secondary metabolites, and ultimately improve the expression level of metabolites. The invention is the first time that the construction method of the strain is applied to the transformation of the strain of the industrial microorganism, which provides a new method for the microbial breeding.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物育种和生物
，具体涉及一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及构建的菌株，及其在工业微生物的菌种改造中的应用。
技术介绍
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中。溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用，与抗生素复合应用能增强抗生素疗效。它还是人体内的非特异性免疫因子，可提高机体的免疫力，并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子具有很好的协同作用。目前溶菌酶已广泛应用于各种加工食品和饮料中，集药理、保健和防腐为一体，具有广泛的应用价值。但目前尚未有通过调节溶菌酶的表达来用于微生物育种的报道。对于微生物育种而言，目前所涉及的育种方法主要有诱变育种技术、定向进化育种技术和基因工程改造等，以棒状链酶菌为例，克拉维酸是由棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)合成的一种次级代谢产物，是临床上常用的β-内酰胺酶抑制剂，可与阿莫西林或替卡西林联合用药，用于治疗耐药性致病菌感染，具有重要的临床价值。棒状链霉菌的发酵水平是决定克拉维酸生产成本的重要因素，因此选育克拉维酸高产菌株具有重要的工业价值。多种新型育种方法已经在棒状链霉菌育种工作中得到应用，比如报告基因辅助的诱变育种技术、定向进化育种技术和基因工程改造等，但是这些技术都集中在对克拉维酸合成基因和调控基因的改造上，希望通过提高克拉维酸合成酶或正调控基因的表达水平，或通过增强克拉维酸合成酶活性进而提高克拉维酸的合成效率。但是由于克拉维酸属于次级代谢产物，其合成途径受到广泛的调控，仅改造单个或数个基因往往无法预料整个代谢流向的改变，影响理想高产菌株的获得。因此，开发一种新的棒状链霉菌的改造方法，并获得高产克拉维酸的菌株具有非常重要的实际应用价值。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法及其在工业微生物菌种改造中的应用。本专利技术的另一目的是提供一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌及其构建方法。本专利技术不直接改造克拉维酸的合成基因或调控基因，而是通过提高内源性溶菌酶的表达量来增强细胞通透性，进而提高底物摄取效率和克拉维酸产量。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的一个方面涉及一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：首先构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。本专利技术通过上述构建方法提高了菌株内源性溶菌酶活性，进而增强细胞通透性和产物合成效率。上述菌株的构建方法在工业微生物菌种改造中的应用也是本专利技术的保护范围。所述工业微生物菌种改造是指提高工业微生物代谢产物的合成量。本专利技术的另一方面涉及一种超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌的构建方法，包括如下步骤：以生产克拉维酸的棒状链霉菌菌株作为出发菌株，构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。所述超表达载体的构建方法为：采用PCR克隆棒状链霉菌的内源性溶菌酶基因，将PCR产物用XbaI和BamHI进行酶切，凝胶琼脂糖电泳分离后回收酶切产物，并与同样酶切的穿梭载体pHZ1272进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子提取质粒进行酶切鉴定。优选的，所述内源性溶菌酶基因为带有强启动子的内源性溶菌酶基因SCN_RS20110。PCR克隆所采用的引物为：上游引物：GCTCTAGAATGACCACTTCCAGATACTCT；(SEQIDNO.1)下游引物：GCGAATTCTCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC。(SEQIDNO.2)PCR克隆所采用的扩增体系为：棒状链霉菌基因组DNA2μl、PCR缓冲液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，补加超纯水至50μl。PCR克隆所采用的扩增条件为：97℃预变性10分钟；97℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环28次；终延伸8分钟。本专利技术的再一方面涉及一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌，该菌株为棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6，已于2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.12830。该棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6，是以棒状链霉菌工业菌株B02作为出发菌株，采用上述超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌的构建方法而构建得到。进一步的，本专利技术还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6。上述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6和/或上述菌剂在制备克拉维酸中的应用也是本专利技术的保护范围。进一步的，上述棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)LY6和/或上述菌剂在制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术首次提供了一种超表达内源性溶菌酶菌株的构建方法，采用超表达技术，通过高表达内源性溶菌酶基因，改善工业菌株的细胞通透性，增强营养物质的摄取和次级代谢产物的分泌效率，最终提高了代谢产物的表达水平。本专利技术并且首次提出将该菌株的构建方法应用于工业微生物的菌种改造，为微生物育种提供了一条全新的方法。(2)通过采用本专利技术的菌株构建方法，本专利技术构建得到了一株超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌，发酵验证发现，采用本专利技术方法构建的棒状链霉菌，其克拉维酸发酵水平比出发菌株高1.5倍以上，可应用于工业化发酵生产，具有重要的经济价值。(3)本专利技术通过改善工业菌株的细胞通透性来提高目标产物的发酵水平，针对性非常强，符合工业生产菌株的育种需要，易于在其他工业微生物菌种的育种改造中推广应用。附图说明图1：Real-timePCR分析内源性溶菌酶的转录水平差异；图2：克拉维酸发酵水平比较。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1：内源性溶菌酶基因的超表达重组菌株的构建采用PCR克隆棒状链霉菌的内源性溶菌酶基因(内源性溶菌酶基因带有强启动子的内源性溶菌酶基因SCN_RS20110)，构建到链霉菌超表达载体pHZ1272中(pHZ1272为常规的市售质粒载体)。PCR的引物为：上游引物LYSForward序列是GCTCTAGAATGACCACTTCCAGATACTCT(SEQIDNO.1)；下游引物LYSReverse序列是GCGAATTCTCAGCCGTTGGCGAGTGCCAC(SEQIDNO.2)。PCR体系：棒状链霉菌基因组DNA2μl、PCR缓冲液5μl、高保真DNA聚合酶1μl、dNTP2μl、上游引物2μl、下游引物2μl，补加超纯水至50μl。PCR条件：预变性97℃10分钟，变性97℃30秒，退火62℃30秒，延伸72℃1分钟，循环28次，终延伸8分钟。将PCR产物用XbaI和BamHI进行双酶切，凝胶琼脂糖电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：首先构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种超表达内源性溶菌酶的菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下：首先构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。2.权利要求1所述的菌株的构建方法在工业微生物菌种改造中的应用。3.一种超表达内源性溶菌酶的棒状链霉菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以生产克拉维酸的棒状链霉菌作为出发菌株，构建内源性溶菌酶的超表达载体，然后将超表达载体通过接合转移转入至出发菌株中，筛选得到内源性溶菌酶超表达的基因工程菌。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述超表达载体的构建方法为：采用PCR克隆棒状链霉菌的内源性溶菌酶基因，将PCR产物用XbaI和BamHI进行酶切，凝胶琼脂糖电泳分离后回收酶切产物，并与同样酶切的穿梭载体pHZ1272进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子提取质粒进行酶切鉴定。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述内源性溶菌酶基因为带有强启动子的内源性溶菌酶基因SCN_RS20110。6.如权利要求4所述的构建方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟传青，曹广祥，付加芳，宗工理，
申请(专利权)人：山东建筑大学，山东省医药生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37