BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用，涉及分子生物学的技术领域。本发明专利技术提供的BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，解决了BANCR基因研究中所需要的过表达载体的技术问题，使BANCR基因研究更直观；本发明专利技术提供的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，流程简单，阳性率高；本发明专利技术提供的BANCR慢病毒具备良好的生物安全性；此外，本发明专利技术还提供了BANCR慢病毒的构建方法及BANCR基因过表达慢病毒载体和/或BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。

【技术实现步骤摘要】
BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是涉及一种BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用。
技术介绍
目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一。将目的基因通过转染(包括电转染、脂质体转染等)、显微注射或病毒感染等方法将外源基因导入细胞内，从而建立目的基因过表达的稳定细胞系，可广泛应用于生物学研究。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转染效率。慢病毒是一种分子生物学中对基因功能研究常见的工具质粒，能高效转染原核以及真核细胞，使细胞能够合成并且表达目的基因，通过对比目的基因在细胞内表达与否或者表达强度，实现对目的基因在细胞甚至机体功能中的作用进行验证和分析。因此，慢病毒在研究基因在细胞及机体功能中的应用极为广泛。遗传学的“中心法则”描述了遗传信息从DNA通过RNA到相应蛋白质的信息流途径。几十年来，传统观点认为DNA是遗传物质的储存载体，基因要通过其表达的相应蛋白质来发挥作用。随着人类基因组计划的顺利完成，人们发现仅仅一小部分基因为蛋白编码基因，而90％以上的人类基因都已经发生了转录，这表明众多数量的转录本是不编码蛋白质的，这部分转录本被称为“非编码RNA”(non－codingRNA，ncRNA)。结构ncRNA在蛋白质翻译过程中发挥重要作用，包括转移RNA(transferRNA，tRNA)，核糖体RNA(ribosomalRNA，rRNA)，小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)和核仁小RNA(smallnucleolarRNA，snoRNA)；调节ncRNA包括小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，微小RNA(microRNA，miRNA)，piwi蛋白相互作用的RNA(piwi－interactingRNAs，piRNAs)和长链非编码(longnoncodingRNA，lncRNA)。lncRNA长度在200个核苷酸以上，大部分lncRNA被视为缺乏蛋白质编码的能力，极小部分lncRNA被证实可以编码一些小肽段。研究发现lncRNA可通过表观遗传、转录和转录后及代谢等多层面参与蛋白编码基因和非蛋白编码基因的表达调控。lncRNA在正常细胞分化、发育及人类疾病发生发展过程中发挥重要作用，包括恶性肿瘤。BRAF活化的非编码RNA(BRAF－activatednon－proteincodingRNA，BANCR)是一种与黑色素瘤发生发展密切相关的lncRNA。该基因定位于染色体9q21.11，含4个外显子，BANCR是来自内含子的转录产物，长约693nt，在BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞及黑色素瘤组织中高表达。体内外研究发现BANCR可通过激活ERK1/2和JNKMAPK信号转导通路参与黑色素瘤细胞的增殖调控，但是BANCR与MAPK信号转导通路之间的关系尚未完全阐明。此外，研究还发现BANCR可通过调控CXCL11基因的表达参与黑色素瘤细胞的迁移。鉴于BANCR在恶性黑色素瘤中的表达具有组织特异性及稳定性，可作为潜在的肿瘤诊断和肿瘤靶向治疗的生物学标记物。在目前的国内外尚未见到BANCR基因过表达慢病毒载体及其相关研究的报道。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体，以解决BANCR基因研究中所需要的过表达载体的技术问题；本专利技术的第二个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，以构建BANCR基因过表达慢病毒载体；本专利技术的第三个目的在于提供一种BANCR慢病毒；本专利技术的第四个目的在于提供一种BANCR慢病毒的构建方法；本专利技术的第五个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体和/或BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。本专利技术提供的一种BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。本专利技术还提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，该方法包括：将利用PCR扩增人工合成的BNACR基因插入到基因转移载体中，得到重组连接产物，用重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性且序列无误的即为构建成功的BANCR基因过表达慢病毒载体。进一步地，所述BANCR基因的上下游引物序列分别为：BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQIDNO.2)BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQIDNO.3)。进一步地，所述BANCR基因的上下游引物分别设有NotI和NsiI两侧同源序列，用于慢病毒载体的亚克隆。进一步地，所述插入到基因转移载体中使用的试剂盒为EntryOneStepCloningKit试剂盒。进一步地，所述基因转移载体为经过NotI和NsiI双酶切的表达绿色荧光蛋白的LV5。本专利技术还提供了一种BANCR慢病毒的构建方法，使用包装质粒对上述的BANCR基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到BANCR慢病毒。进一步地，所述包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV－G。本专利技术还提供了一种BANCR慢病毒，应用上述的BANCR慢病毒的构建方法构建得到。本专利技术还提供了上述的BANCR基因过表达慢病毒载体和/或上述的BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。本专利技术提供的BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，能够准确追踪载体进入细胞内的位置，并且能够了解不同环境下BANCR基因的强弱表达，使BANCR基因研究更直观。本专利技术提供的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，流程简单，阳性率高。本专利技术提供的BANCR慢病毒具备良好的生物安全性，可直接用于感染其他的细胞株，进行体外机制研究；或者筛选稳定株，用于体内功能研究。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例2提供的LV5质粒的物理图谱；图2为本专利技术实施例2提供的已插入BANCR的重组载体图；图3为本专利技术实施例3提供的PCR扩增的目的基因BANCR的测序结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BANCR基因过表达慢病毒载体，其特征在于，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种BANCR基因过表达慢病毒载体，其特征在于，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。2.权利要求1所述的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，其特征在于，该方法包括：将利用PCR扩增合成的BANCR基因，插入到基因转移载体中，得到重组连接产物，用重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性且序列无误的即为构建成功的BANCR基因过表达慢病毒载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述BANCR基因的上下游引物序列分别为：BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQIDNO.2)BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQIDNO.3)。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱月春，杨丽娟，白宏刚，蒋露，杨雨叶，杨慧鑫，易子寒，张巧，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南,53