转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法，其特征在于将所需转录因子分别克隆至慢病毒载体，包装成病毒颗粒并转染至成纤维细胞；利用过表达转录因子的方法诱导成纤维细胞转分化为诱导型睾丸间质细胞，其中所述转录因子来源于人、小鼠或大鼠，并且所述转录因子为选自由Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4组成的组中的部分或全部转录因子的组合。转分化后的细胞具有成熟睾丸间质细胞类似的雄激素合成相关基因的表达谱，并能合成和分泌睾酮。通过本发明专利技术制备的类睾丸间质细胞可用于治疗雄性性腺机能减退综合征。

Method for combining transcription factor combinations to induce fibroblasts to differentiate into Leydig cells

The invention relates to a method for inducing fibroblast to differentiate into interstitial cells of the testis type method, which is characterized in that the transcription factors were cloned into the lentiviral vector, packaged into virus particles and transfected into fibroblasts; using the method of expression of transcription factor induced fibroblast transdifferentiation induced testis interstitial cells, wherein the transcription factor derived from human, mouse or rat, and the combination of transcription factors for selected Dmrt1, Nr0b1, Sp1, Wt1, Nr4a1, Nr5a2, AP1, Creb1, Smad3, Nr5a1 and Gata4 in the group consisting of all or part of the transcription factor. The differentiated cells have similar expression profiles of genes related to androgen synthesis in mature Leydig cells, and synthesize and secrete testosterone. The testis like stromal cells prepared by the present invention can be used for the treatment of male hypogonadism syndrome.

【技术实现步骤摘要】
转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法
本专利技术属生物医学领域，涉及细胞转分化的过程及其用途，具体涉及利用慢病毒载体表达多种转录因子诱导成纤维细胞转分化为具有雄激素合成分泌功能的类睾丸间质细胞的方法，同时利用这种类睾丸间质细胞移植到雄性睾丸间质内，为治疗雄性性腺机能减退综合征提供新的治疗方法。
技术介绍
睾丸间质细胞是雄性个体睾酮的主要来源，对雄性精子发生、性别分化和第二性征的发育和维持起着至关重要的作用。睾丸间质细胞合成睾酮能力在青春期后随着年龄的增长而逐渐下降。与此同时，环境污染、生活节奏的加快、和人口老龄化等因素使得睾丸间质细胞自身功能障碍引发的雄激素不足或缺乏症，即性腺机能减退(hypogonadism)的发病率逐年升高。传统的雄性激素进行替代治疗对性腺机能减退有一定的作用，但这种治疗要持续终身，副作用十分显著，容易出现肝脏功能损害、精子生成减少、前列腺癌等并发症，有副作用的同时还给患者带来极大的经济压力(Wang等，J.Androl.，2009，32(1)：1-10；Chen等，Endocrindogy，2002，143(5)：1637-1642)。随着组织工程技术的发展，国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗性腺机能减退，取得了较好的效果。但睾丸间质细胞仅存于睾丸，数量有限(仅占睾丸细胞总量的2-5％)，虽然对睾丸间质细胞已经有了较为成熟的分离方法，但分离过程中的细胞损失不可避免，且成年睾丸间质细胞不能再进行有丝分裂，未成熟的睾丸间质细胞在后续培养中又会失去其分裂特性，这些因素加剧了睾丸间质种子细胞的稀缺。此外，这种移植普遍依靠同种异体供应，患者术后需要长期服用免疫抑制剂，副作用大的同时还承受着一系列伦理学争议，极大地限制了该技术在临床上的广泛应用。尽管间充质干细胞或胚胎干细胞也可用于诱导分化为能产生类固醇的类睾丸间质细胞，但要将这些细胞用于临床研究仍然存在着以下几方面的缺陷：(1)诱导干细胞或者iPSCs(inducedpluripotentstemcells，即，诱导的多能干细胞)分化为睾丸间质细胞的分化效率和纯度都很低，且得到的细胞生成类固醇的能力非常有限；(2)胚胎干细胞面临免疫排斥、伦理道德问题及植入部位形成畸胎瘤风险；(3)间充质干细胞表型不均一，其鉴定无明确标准，分离纯化及大量扩增面临技术困难；(4)虽然iPSCs规避了胚胎干细胞带来的伦理问题，但是其来源的可靠性和技术安全性仍是临床应用中所面临的最大障碍。成体细胞转分化技术与干细胞定向分化技术相比具有诱导时间短，诱导效率高，细胞致瘤性低，且转分化过程不需要依赖于细胞的分裂等明显的优势，因而被认为是未来人类再生医学的重要的技术手段。该技术能直接将体细胞转分化为其它类型细胞，为再生医学提供了极其宝贵的资源，它使得用非胚胎材料获得病人特异的任何谱系的细胞成为可能。近年来已经有研究表明，转录因子能被诱导成纤维细胞转分化多种类型的细胞，包括心肌细胞、神经细胞、肝样细胞、软骨细胞等，这些都充分体现了转分化技术在再生医学领域的巨大潜能。如果能将成纤维细胞转分化为具雄激素合成和分泌功能的类睾丸间质细胞，则可同时解决临床细胞治疗中睾丸间质细胞移植种子细胞来源不足以及免疫排斥两个实际问题。这是目前本领域研究的焦点。但是，目前还没有关于利用何种转录因子或转录因子组合能够诱导类睾丸间质细胞的相关报道。
技术实现思路
鉴于现有技术的缺点，本专利技术主要解决的技术问题是提供一种利用转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法。通过该方法获得的类睾丸间质细胞(InducedLeydig-likecells，iLCs)可用于治疗雄性性腺机能缺乏综合征。在第一方面，本专利技术提供一种利用转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法，所述方法包括将所需转录因子分别克隆至慢病毒载体，包装成病毒颗粒并转染至成纤维细胞；利用过表达转录因子的方法诱导成纤维细胞转分化为诱导型睾丸间质细胞。本领域技术人员应该理解，用于本专利技术的成纤维细胞可以从相应地动物或人体中提取(主要是胚胎成纤维细胞和成体成纤维细胞)，或者通过基因工程方法诱导胚胎干细胞或者iPSCs分化所得的成纤维细胞(YangY，etal.Stemcellsanddevelopment，2015，24(4)：459-70；SonoyamaT，etal.Endocrinology，2012，153(9)：4336-45)。可用的成纤维细胞可以来源于皮肤，例如鼠尾或者人皮肤的成纤维细胞，也可以是内脏成纤维细胞(例如，心脏等的成纤维细胞)或者是胚胎成纤维细胞。用于本专利技术的转录因子可以从相应的动物或者人体细胞中提取，来源可以包括，但不限于，人、小鼠和大鼠。而这些转录因子的核苷酸序列可以按照Itatura等人所述的方法(Science，1977，198：1056-1063)来合成，也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞的转化和培养以及表达产物的分离鉴定等操作(参见Sambrooketal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)。用于本专利技术的转录因子选自Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1或Gata4。优选地，用于本专利技术的转录因子是选自由Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4组成的组中的部分或全部转录因子的组合。所述转录因子组合可以为Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrt1、Sp1、Wt1、AP1、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrtl、Wt1、AP1、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrt1、Sp1、Wt1、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrt1、Sp1、AP1、Nr5a1和Gata4的组合；Dmrt1、Nr5a1、Gata4和Wt1的组合或者Nr5a1、Gata4、Dmrt1和AP1的组合；或Dmrt1、Gata4和Nr5a1的组合。最优的转录因子组合为Dmrt1、Nr5a1和Gata4的组合；其次是Dmrt1、Nr5a1、Gata4和Wt1的组合或者Nr5a1、Gata4、Dmrt1和AP1的组合；再次是Dmrt1、Sp1、Wt1、AP1、Nr5a1和Gata4；最后为11种因子的组合，即Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4的组合。本专利技术中所述的转录因子Dmrt1(DoublesexandMab-3RelatedTranscriptionfactor1)核苷酸序列为SEQIDNos：1-3；本专利技术中所述的转录因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法，其特征在于将所需转录因子分别克隆至慢病毒载体，包装成病毒颗粒并转染至成纤维细胞；利用过表达转录因子的方法诱导成纤维细胞转分化为诱导型睾丸间质细胞，其中所述转录因子来源于人、小鼠或大鼠，并且所述转录因子为选自由Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4组成的组中的部分或全部转录因子的组合。

【技术特征摘要】
1.一种诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法，其特征在于将所需转录因子分别克隆至慢病毒载体，包装成病毒颗粒并转染至成纤维细胞；利用过表达转录因子的方法诱导成纤维细胞转分化为诱导型睾丸间质细胞，其中所述转录因子来源于人、小鼠或大鼠，并且所述转录因子为选自由Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Creb1、Smad3、Nr5a1和Gata4组成的组中的部分或全部转录因子的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转录因子组合为Dmrt1、Gata4和Nr5a1的组合。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转录因子组合为Dmrt1、Nr0b1、Sp1、Wt1、Nr4a1、Nr5a2、AP1、Nr5a1和Gata4的组合。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述转录因子组合为Dmrt1、Sp1、Wt1、AP1、Nr5a1和Gat...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亚东，苏志坚，杨艳，葛仁山，项琪，张齐好，
申请(专利权)人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，
类型：发明
国别省市：广东,44