一种PBMC体外诱导分化成为树突状细胞的方法技术

本发明专利技术涉及医用生物细胞培养方法，特别涉及一种树突细胞培养方法。所述方法，包括以下步骤：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入培养基培养，得到未成熟的树突状细胞；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞超高压灭菌处理，取出后进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：将培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激；得到成熟的树突状细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医用生物细胞培养方法，特别涉及一种树突细胞培养方法。
技术介绍
树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。关于DC疫苗的临床治疗应用，目前主要限于肿瘤患者的临床实验及临床治疗。包括有淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、肾癌、自血病、肺癌等。肿瘤细胞抗原的处理，超高压灭菌(下面也称为UHP)就是在密闭的超高压容器内，用水作为介质对软包装食品等物料施以300～600MPa的压力或用高级液压油施加以100～1000MPa的压力。从而杀死其中几乎所有的细菌、霉菌和酵母菌，而且不会像高温杀菌那样造成营养成分破坏和风味变化。超高压力杀死的肿瘤细胞可以向未成熟的树突状细胞提供有效的活化刺激原，甚至在没有额外的刺激原存在的情况下也如此。由该方法所杀死的肿瘤细胞表达高水平的免疫原性细胞死亡标记，而装载有这些免疫原性肿瘤细胞的未成熟的树突状细胞具有更强的特异性。辐照杀菌广泛用于食品卫生和医疗领域用以对物品进行可穿透性灭菌及生物物体灭活。与热杀菌不同的是，辐照杀菌同UHP技术为不致灭菌物体温度升高的冷杀菌方法。OK432制剂是一种作用于肿瘤的药物。是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。OK432激活的中性粒细胞能够杀死IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。OK432诱导的中性粒细胞对自体瘤细胞的杀伤作用通过CD11b/CD18和ICAM-1之间的反应实现的。OK432诱导的单核细胞能够杀死自体瘤细胞。OK432可提高T细胞和NK细胞活性，可调节T细胞亚群使T3、T4、及T4/T8比值全面上升。OK432刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞甚至对抗NK细胞的瘤细胞都显示出活性。现有技术在培养和扩增树突状细胞的过程中存在一些缺陷，本专利技术在研究这些缺陷后，专利技术了一种新的培养和扩增树突状细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种PBMC体外诱导分化成为树突状细胞的方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入培养基培养，得到未成熟的树突状细胞；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞超高压灭菌处理，取出后进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：将培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激；得到成熟的树突状细胞。优选的，本专利技术的方法，步骤如下：步骤1、白细胞分离：白细胞分离后溶解于18-25℃之间的PBS-EDTA中，并使用淋巴细胞分离液进行梯度密度离心，以分离单个核细胞(PBMC)，随后对收集到的单个核细胞进行洗涤；在对收集后的单个核细胞进行细胞计数和活力检测后以每平方厘米1×107个的密度将细胞接种于三层培养瓶中，进行差速铁壁培养，培养结束后，取出培养瓶；小心旋转震荡培养瓶，除去未贴壁细胞。用平衡至室温的PBS洗培养瓶3次，每次50mL。将三层培养瓶中的PBS倒净，得到单核细胞。步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入135mL 1640培养基，15mL血清替代物，1500U/mL IL-4和3000U/mL GM-CSF，小心震荡后放入37℃5％CO2条件下培养，培养时间100小时，于第四天向每瓶细胞中补充15mL1640培养基，1.5mL血清替代物，1500U/mL IL-4和3000U/mL GM-CSF混合液；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液，将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内，以300-600MPa，压力下处理10-30分钟，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：于第六天收集经过培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激，将未成熟树突状细胞与经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞按照1:1至20:1的比例接种8小时，加入0.5KE/mL OK432用以刺激树突状细胞成熟化，并于24小时后收获成熟的树突状细胞。本专利技术的培养方法可大幅提高外周血单个核细胞来源的体外扩增的树突状细胞的纯度、迁移活性和杀伤活性。本专利中对经过UHP处理后的肿瘤细胞进行再次灭活，以保证没有有致瘤风险的活肿瘤存在于处理后的样品中。本专利技术的实验数据显示，使用超高压力杀死的肿瘤细胞导致肿瘤抗原的有效呈递，从而诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。其中，步骤1中的差速铁壁培养，培养基为：1640培养基其中，步骤2中的未成熟的树突状细胞培养，培养基为：1640培养基加血清替代物本专利技术的目的在于：1.提供了一种体外以白细胞单采血为来源的DC细胞培养方法；2.该培养方法提高了体外诱导DC细胞的能力，提高了细胞得率；3.该培养方法让DC获得了肿瘤抗原。4.该培养方法可以增强DC细胞的活化性受体表达，提高DC细胞的对免疫系统的激活能力；本方的优点在于：1.提高了PBMC体外诱导转化DC细胞的能力；2.提高了DC细胞在细胞终产品中的纯度；3.提高了肿瘤细胞抗原的有效性及安全性。4.提高了DC细胞激活淋巴细胞对靶细胞的杀伤能附图说明：图1、在D-VEX与淋巴细胞按1:2比例共培养时，培养基上清中IFN-γ浓度持续升高，提示D-VEX可以有效的刺激自体T细胞的活化。(n＝5)图2、在D-VEX与淋巴细胞按1:10比例共培养时，培养基上清中IFN-γ浓度持续升高，提示D-VEX可以有效的刺激自体T细胞的活化。(n＝5)图3A、mDC:Lympho＝1:2体系中，共培养前和共培养24小时后T细胞分泌IFN-γ水平升高。(n＝5)图3B、mDC:Lympho＝1:10体系中，共培养前和共培养24小时后T细胞分泌IFN-γ水平升高。(n＝5)图4A、mDC体外对自体T细胞的活化作用图图4B、培养上清中INF-γ浓度的变化图随着同培养时间的延长，上清中INF-γ的含量持续升高，提示mDC可以有效的刺激自体T细胞的活化，1:2共培养时mDC对T细胞的活化能力在8-21小时过程中强于1:10的培养体系，随着时间的推移二者差距逐渐减小，提示了DC被稀释后仍能在一定时间内持续发挥对淋巴细胞的激活作用。(n＝5)具体实施方式：以下通过实施例进一步说明本专利技术。实施例1.一种生产可实现人体主动性免疫的树突状细胞的方法：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞。在一个优选实施方案方式中，白细胞分离术的产物溶解于18-25℃之间的PBS-EDTA中，并使用淋巴细胞分离液(东方华辉)进行梯度密度离心，以分离单个核细胞(PBMC)，随后对收集到的单个核细胞进行洗涤。在一个优选实施方案方式中，每管加入预冷的PBS-EDTA至终体积50mL，4℃下离心10分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PBMC体外诱导分化成为树突状细胞的方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入培养基培养，得到未成熟的树突状细胞；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞超高压灭菌处理，取出后进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：将培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激；得到成熟的树突状细胞。

【技术特征摘要】
1.一种PBMC体外诱导分化成为树突状细胞的方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入培养基培养，得到未成熟的树突状细胞；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞超高压灭菌处理，取出后进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：将培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激；得到成熟的树突状细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、白细胞分离：白细胞分离后溶解于18-25℃之间的PBS-EDTA中，并使用淋巴细胞分离液进行梯度密度离心，以分离单个核细胞，随后对收集到的单个核细胞进行洗涤；在对收集后的单个核细胞进行细胞计数和活力检测后以每平方厘米1×107个的密度将细胞接种于三层培养瓶中，进行差速铁壁培养，培养结束后，取出培养瓶；小心旋转震荡培养瓶，除去未贴壁细胞，用平衡至室温的PBS洗培养瓶3次，每次50mL，将三层培养瓶中的PBS倒净，得到单核细胞。步骤2、未成熟的树突状细胞培养：单核细胞中加入135mL 1640培养基，15mL血清替代物，1500U/mL IL-4和3000U/mL GM-CSF，小心震荡后放入37℃5％CO2条件下培养，培养时间100小时，于第四天向每瓶细胞中补充15mL1640培养基，1.5mL血清替代物，1500U/mL IL-4和3000U/mL GM-CSF混合液；步骤3，肿瘤细胞抗原的获取：将肿瘤细胞与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液，将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内，以300-600MPa，压力下处理10-30分钟，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌；步骤4、树突状细胞成熟化：于第六天收集经过培养得到的未成熟的树突状细胞，用经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞抗原进行荷载，并使用OK432进行成熟化刺激，将未成熟树突状细胞与经过超高压灭菌处理与辐照处理的肿瘤细胞按照1:1至20:1的比例接种8小时，加入0.5KE/mL OK432用以刺激树突状细胞成熟化，并于24小时后收获成熟的树突状细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中的差速铁壁培养，培养基为：1640培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中的未成熟的树突状细胞培养，培养基为：1640培养基加血清替代物。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1、白细胞分离：每管加入预冷的PBS-EDTA至终体积50...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡杨，赵宇，谷玉杰，刘彩云，李帅民，王敏，贾乐伟，
申请(专利权)人：北京时合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11