本发明专利技术属于细胞技术领域，具体涉及一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法。本发明专利技术在脐带血总有核细胞中加入含有50μmol/L白藜芦醇的I型干细胞培养基培养72小时后，更换不含白藜芦醇的II型干细胞培养基继续培养，最后显著提高了巨核祖细胞的高分化效率。本发明专利技术揭示了先使用含50μmol/L白藜芦醇I型干细胞培养基培养处理后，再更换不含任何白藜芦醇成分II型干细胞培养基继续培养，通过这两种培养基的先后培养顺序组合能显著提高脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率，可制备纯度更高的巨核祖细胞。该方法过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞
，具体涉及一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效 率的方法。
技术介绍
1989年世界上第一次进行脐带血造血干细胞移植并获得成功后，脐带血造血干细 胞的临床应用便越来越广泛，经过20多年的发展，目前脐带血已经和骨髓、外周血一起成 为造血干细胞的三大来源。 相对于骨髓，脐带血移植后血小板的恢复速度稍慢一些，目前普遍认为原因是脐 带血中的巨核祖细胞数量不充裕且分化成熟迟缓。由于在造血干细胞移植前，受者通常要 进行大剂量放疗/化疗以达到清髓效果，而放疗/化疗会使受者的造血系统严重受损，导致 一段时间内血小板严重缺乏，容易出血甚至引起死亡，所以需要输注大量外源的血小板。而 在造血干细胞移植后，血小板的恢复情况也是影响移植成败的重要原因。所以，对于脐带血 移植而言，血小板的作用巨大。 造血干细胞具有自我更新能力并能最终分化为各种血液成分细胞。造血干细胞可 分化为巨核祖细胞（Megakaryocyticprogentitorcell，MKPC)，然后进一步分化为成熟的 巨核细胞，最终释放出血小板。近年研究发现，将异体脐带血造血干细胞在体外定向扩增 为巨核祖细胞，造血干细胞移植时在需要的时候输注到移植受者体内，是有可能解决放疗/ 化疗后血小板缺乏和脐带血移植后血小板恢复延迟的重要临床方法。 由于脐带血的造血干细胞的含量比例低于骨髓，而且脐带血中的巨核祖细胞数量 较少成熟迟缓，所以如何提高脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率具有实际的 临床意义。当前，脐带血造血干细胞体外巨核祖细胞定向扩增普遍采用的细胞因子组合进 行扩增，主要有IL-3,IL-6,SCF，TPO,FLT等。 白藜芦醇是一种天然的植物抗体，存在于葡萄科、百合科、豆科等70多种植物中， 当植物遭遇到真菌感染、紫外线等不利条件时产生的酚类化合物，对植物起保护、防御作 用。在医学上，白藜芦醇的抗心血管疾病作用因"法国悖论"而始被学者们认识，随着世界 范围内的进一步研究，白藜芦醇在抗肿瘤、免疫调节、抗衰老等方面的生物学作用逐渐被 发现。在造血干细胞的分化方面，白藜芦醇可加速红系祖细胞的成熟，在体外扩增时提高 CFU-GM的集落生成数量。 随着分子生物学及信号通道的深入研究发现，白藜芦醇对MAPK或NF-kB信号通道 有明显的作用效果，在癌细胞方面，如Hela细胞、MCF-7细胞等，通过较高浓度的白藜芦醇 处理（60ymol/L)，可促使p38MAPK信号通道激活，从而致使癌细胞凋亡。p38MAPK信号通 道还参与了多种细胞因子及其生理作用过程的信号传导，但不同类型细胞对于P38MAPK信 号通道有不同的敏感程度，鉴于白藜芦醇对P38MAPK信号通道的作用，可以用白藜芦醇来 歧化不同类型的细胞，从而达到优化培养的效果。 脐带血采集后去除血浆和红细胞，得到富含造血干细胞的总有核细胞（TNC)。总有 核细胞含有大量各种类型的细胞，复杂的成分对造血干细胞体外扩增和分化的效率有不良 影响。虽然通过磁珠分选可获得较纯的造血干细胞，优化体外扩增和分化的结果，但成本的 大幅度增加对于大量扩增需要的情况有极大制约，同时更多的操作步骤也带来更大的污染 风险。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足与缺点，本专利技术首要目的在于提供一种提高脐带血巨核 祖细胞体外诱导分化效率的方法，该方法制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低， 兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，为临床应用提供了更可靠的支持。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现： ，包含如下步骤： 以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用I型干细胞培养基进行首阶段培养72小 时，然后更换II型干细胞培养基继续培养，通过这两种不同成分的干细胞培养基的先后培 养顺序组合，显著提高了脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的效率； 所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50ymol/L白黎芦醇的干细胞培养基； 所述的I型干细胞培养基优选为含有终浓度50ymol/L白黎芦醇、人白细胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白细胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干细胞生长因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干细胞培养 基； 所述的I型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的终浓度分别优选为20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL; 所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基（STEMCELL公司）； 所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基； 所述的II型干细胞培养基优选为不含任何白藜芦醇成分但含有人白细胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白细胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干细胞生长因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干细胞培养 基； 所述的II型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的终浓度分别优选为20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL; 所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基（STEMCELL公司）； 所述的继续培养的时间优选为1~11天； 所述的提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，优选包含如下具体步 骤： (1)配制培养基：将白藜芦醇溶于细胞保护剂中，得到白藜芦醇储存溶液；然后将 白藜芦醇储存溶液添加到干细胞培养基中，得到I型干细胞培养基； (2)诱导分化：将脐带血造血干细胞接种于步骤（1)制备得到的I型干细胞培养 基，首阶段培养72小时； (3)继续培养阶段：将步骤⑵中培养后的细胞离心去上清，接种于II型干细胞 培养基中，继续培养； 步骤⑴中所述的白藜芦醇的纯度彡99%，GC; 步骤⑴中所述的白藜芦醇储存溶液浓度为10mm〇l/L，该浓度为储存浓度，工作 浓度跟储存浓度一致，须放置于4°C遮光保存； 步骤（1)中所述的细胞保护液为含有体积百分比为55%二甲基亚砜（DMS0)和体 积百分比为5%低分子右旋糖酐（Dextran)的注射用水溶液； 步骤（1)中所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50ymol/L白黎芦醇的干细胞 培养基； 步骤（1)中所述的I型干细胞培养基优选为含有终浓度50ymol/L白黎芦醇、人 白细胞介素 _3 (Interleukin-3,IL-3)、人白细胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干细胞 生长因子（Stemcellfactor,SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TPO)的造血干细 胞培养基； 所述的I型干细胞培养基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的终浓度分别优选为20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL; 所述的造血干细胞培养基优选为Stemspan培养基（STEMCELL公司）； 步骤（3)中所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养 基； 步骤（3)中所述的II型干细胞培养基优选为不含任何白藜芦醇成分但含有人白 细胞介素 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高脐带血巨核祖细胞体外诱导分化效率的方法，其特征在于包含如下步骤：以脐带血造血干细胞为标本细胞，使用I型干细胞培养基进行首阶段培养72小时，然后更换II型干细胞培养基继续培养；所述的I型干细胞培养基为含有终浓度50μmol/L白黎芦醇的干细胞培养基；所述的II型干细胞培养基为不含任何白藜芦醇成分的干细胞培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：嵐山芮，魏伟，袁嘉恩，
申请(专利权)人：广州市天河诺亚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。