一种修饰的增强型靶向免疫细胞群的制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种修饰的增强型DC‑CIK细胞靶向免疫细胞群及其制备方法和用途，其中制备DC细胞的方法包括：单核细胞进行分离培养，以便获得未成熟的DC细胞；将未成熟DC细胞进行肿瘤抗原负载并进行诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞，其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。制备CIK的方法包括：CIK细胞体外分化培养，获得未成熟的CIK细胞；制备修饰用重组慢病毒对CIK细胞进行体外修饰；修饰后CIK细胞与DC细胞共培养，以便获得成熟的修饰后CIK细胞（Triumph‑DC‑CIK），进而用于获得更好的肿瘤免疫治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种修饰的增强型靶向免疫细胞群的制备方法和用途
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及修饰的增强型DC-CIK细胞靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途，属于细胞生物学、免疫学、肿瘤治疗领域。
技术介绍
恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，成为威胁人类健康的头号杀手。卫生部最新统计数据，据2012年癌症有关报告显示，我国每年新发癌症病例约337万，死亡约211万。癌症已成为我国死亡第一大原因，死亡人数占全球癌症死亡人数四分之一。2012年世界癌症报告显示，每年癌症新发病例约1400万，死亡约800万，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。我国新发病例占全球新发病例22%，死亡人数占26%，超过全球癌症死亡人数的四分之一。男性当中肺癌发病率最高，女性是乳腺癌。目前的肿瘤临床治疗策略中，主要以手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤进行治疗，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗法进行系统性治疗。但治疗效果多半不理想，并常伴有严重的副作用。肿瘤的发生是多步骤、多基因突变作用的结果，表现出生长、分化与凋亡的失控。临床上病人的诊断具有多样性和个体遗传异质性，同时经常办随肿瘤远处转移病灶的出现和复发，使肿瘤治疗必须以全身性疾病的观点，采取全身治疗方案，不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。近年来，随着分子医药技术的发展，肿瘤免疫疗法治疗肿瘤成为肿瘤临床治疗的焦点，为肿瘤患者带来了希望。2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破的首位，细胞免疫治疗方法在理论上有巨大优势：（1）它不损伤降低免疫系统功能，反而增强免疫系统。对活跃繁殖和静止隐藏的癌细胞都有杀伤效果。（2）可以广谱治疗多种癌症，对普遍人群均有效果。（3）可以通过治疗后的免疫监视抑制癌细胞进化，降低复发率。由于肿瘤细胞免疫治疗应用范围广(可用于多种实体肿瘤及白血病)，特别对肿瘤微小病灶(包括转移、复发灶、血液中的癌细胞)更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段(如晚期放、化疗不易使用)，因此具有巨大的应用前景和广阔的市场空间。细胞免疫治疗主要包括CIK和DC细胞：树突状细胞（Dendriticcell，DC）是近年来所发现的最为重要的免疫调控和辅助细胞，它是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原并向T淋巴细胞提呈抗原分子的功能，并表达共刺激分子和粘附分子；且能分泌在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用的Th1型细胞因子IL-12，诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞，认别和杀伤肿瘤细胞。多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中较少，仅1%-5%。人们又发现当在CIK细胞培养时加入肿瘤患者自体的DC后，彼此能相互作用，促进双方细胞的成熟，并诱导除比同源CIK细胞更强增殖活性和更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。本专利技术在对DC细胞和CIK细胞增殖、杀伤特性研究的基础上，对CIK细胞进行早期修饰，并把DC与CIK进行共培养，可产生明显增强的CIK细胞群，其增殖效率和抑瘤细胞活性均有显著增强。程序性死亡受体-1（programmeddeath1，PD-1）PD-1是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为55KD左右，由细胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区组成。PD-1分子最显著的特征是细胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基，分别参与组成免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosine-basedswithmotifs，ITSM)结构域。ITIM能使细胞质段的磷酸化得到恢复，发挥拮抗抗原受体的功能，而ITSM上的酪氨酸残基在PD-1的负性调节中是必需的。PD-1配体包括PD-L1和PD-L2，其中PD-L1广泛表达在T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多种肿瘤细胞及一些非淋巴PD-1/PD-Ls发挥着负性免疫调节作用。当细胞表面的PD-1与PD-Ls耦联后，可导致T细胞胞质区的ITSM结构域的Tyr磷酸化，然后磷酸化的Tyr即可募集磷酸酶蛋白酪氨酸酶-2和蛋白酪氨酸酶-1，不仅可阻滞细胞外信号调节激酶的活化，还可阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-hydroxykinase，PI3K)和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threoninekinase，Akt)的激活，最终抑制T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的分泌。白细胞介素-2（IL-2）的主要生物学功能是促进T细胞的增殖与分化，此外，IL-2也能促进B细胞增殖、分化和分泌抗体，活化自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，增加抗原递呈细胞表面Ⅰ类和Ⅱ类分子的数量及增强抗原递呈作用等。由于IL-2具有广泛的免疫学功能，目前临床上主要用于肿瘤、感染性疾病的治疗，尤其是在肾癌和癌性积液治疗方面疗效明显。研究表明，IL-2并不能直接干预肿瘤细胞的生长或杀死肿瘤细胞，其抗肿瘤机制主要在于刺激、活化大量的效应细胞如CTL、B细胞、NK细胞和LAK细胞等。因此本研究通过在CIK细胞表面过量表达无胞内功能区的PD-1，使之成为肿瘤表面PD-L1的假受体，并且通过linker序列使假受体可以先与PD-L1抑制信号结合，从而减少CIK细胞表面具有胞内功能区的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，减少肿瘤对杀伤性细胞的抑制，同时分泌IL-2对细胞进行增殖激活，极大的增强细胞增殖活性和肿瘤杀伤效果。
技术实现思路
本专利技术公开了一种修饰的增强型DC-CIK细胞靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途，其制备方法如下：1．制备表达人源PD-1-IRES-IL-2片段慢病毒合成序列表的SEQIDNO:1所示的双链DNA分子，将其连入商业化慢病毒载体中，以pWPXL载体系统作为示范例，包括但不限于pWPXL载体，构建出重组质粒pWPXL-PD-1-IRES-IL-2。通过下列常规操作完成病毒包装：a、采用磷酸钙法将重组表达质粒连同辅助质粒共转染HEK293细胞。接种HEK293细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37ºC和5%CO2的条件下培养至对数生长期，收集细胞，于10cm直径的细胞培养皿中接种5×106个细胞，继续培养16～24h。待细胞长至70～80%密度时更换培养基为IMDM，孵育2～4本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备一种用于修饰DC‑CIK细胞的慢病毒，其特征在于包含PD‑1胞外区及跨膜区核酸序列，胞外区与跨膜区之间用linker序列相连，如 SEQ ID NO ：1 所示，以及白细胞介素‑2（IL‑2）核酸序列如SEQ ID NO ：2所示，SEQ ID NO ：1与SEQ ID NO ：2中间以IRES序列如SEQ ID NO ：3所示进行连接，所构成的完整序列如SEQ ID NO ：4所示，该病毒可在感染细胞后在细胞表面表达PD‑1胞外区并分泌IL‑2蛋白，其蛋白序列和SEQ ID NO ：5与SEQ ID NO ：6所示，用于多种肿瘤的治疗。

【技术特征摘要】
2016.11.22 CN 20161103072651.制备一种用于修饰DC-CIK细胞的慢病毒，其特征在于包含PD-1胞外区及跨膜区核酸序列，胞外区与跨膜区之间用linker序列相连，如SEQIDNO：1所示，以及白细胞介素-2（IL-2）核酸序列如SEQIDNO：2所示，SEQIDNO：1与SEQIDNO：2中间以IRES序列如SEQIDNO：3所示进行连接，所构成的完整序列如SEQIDNO：4所示，该病毒可在感染细胞后在细胞表面表达PD-1胞外区并分泌IL-2蛋白，其蛋白序列和SEQIDNO：5与SEQIDNO：6所示，用于多种肿瘤的治疗。2.根据权利要求1所述的方法，所述病毒是通过以下步骤获得的：制备PD-1胞外区及跨膜区-IRES-IL-2核酸序列，将所述序列连入商业化慢病毒载体，以pWPXL系统为例，其中包括但不限于该慢病毒系统，进行载体构建，通过磷酸钙转染的方法，进行病毒包装，收获的病毒经纯化后备用。3.根据权利要求1所述的方法，所述DC-CIK细胞是通过以下步骤获得的：一种制备DC-CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：从外周血中分离淋巴细胞，再通过贴壁处理进行区分，贴壁细胞经过诱导分化培养每2...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：哈尔滨新联合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23