本发明专利技术提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。本发明专利技术通过针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)设置了26条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置了13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出外周血或者其他免疫组织中高达107左右数量级的TCR序列，制备高通量测序文库并测序，通过生物信息学对恒河猴TCR基因免疫组库进行了全面分析。本发明专利技术提供的技术方案对构建恒河猴分析模型意义重大，有利于促进恒河猴模型在研究自体免疫系统疾病和传染病中的应用，也有利于人类对T细胞介导的疾病有更深入和广泛的认识。
【技术实现步骤摘要】
开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用
本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。
技术介绍
T细胞受体(TCR)在细胞免疫中发挥着非常重要的作用，TCR属于异源二聚体分子，在循环系统中，超过95％的TCR的属于αβ类型。在人类外周血中，有超过2×107特异的TCRα和TCRβ配对。所述的免疫组库的复杂性是由淋巴细胞的成熟过程中，染色体上三类基因片段，包括V、D、J基因重排以及三种基因片段连接处的插入缺失生成的。该关键区域也被成为CDR3，是主要的抗原识别位点，也称为互补决定区3(CDR3)，它是TCR基因可变区中最多样和复杂的区域。恒河猴(猕猴)这种动物模型被广泛用于研究许多重要的人类疾病，尤其是用于研究T淋巴细胞在发病机制中的作用。因此，该非人灵长类的TCR序列的表征是非常重要的。早在1992年，GeneLevinsonetal.等，通过传统RT-PCR和克隆的方法，在隆恒河猴的外周血测到了23种TCRβ重排序列。后来，EmmaE.M.Jaeg又在这类猕猴中发现了若干其他的TCRβ序列。通过序列比对，我们发现这些TCRβ在猕猴，黑猩猩和人类中的多样性和结构非常相似，具有很高的同源性。这些前期的工作，一共在恒河猴发现了超过23种Vβ基因，为后续建立更完整的TCRβ序列提供了至关重要的一个公共序列库。然而，由于传统克隆技术的低通量性质，在过去的二十年中恒河猴中发现的有关TCR序列的数目大约也就几百条，远远少于预估的107，这也成为了限制我们了解T细胞在免疫疾病中的演化过程的重要因素。近年来，基于下一代测序这个强大的新技术在免疫系统中的应用，一个新的领域，称为免疫基因组库测序的技术诞生了。我们可以将循环血液中来自单个样品的数以百万计的TCR序列，在单次测序中全部一次性读取。这项技术，最早是在2009年，Weinstein等人，应用高通量测序，估计斑马鱼抗体库的大小，用这种方法，他们在每条鱼中检测到了1200至3700条抗体序列。之后Freeman等人，将该方法用于检测人T细胞检测，并且检测到了33664种不同的TCRβ克隆。随后由于测序方法的改进和通量的增加，Wang等在单个健康人中检测到了113290条独特的TCRβCDR3序列。运用统计模型，估计出的T细胞受体库的总多样性在106左右。运用这种免疫组库测序方法，科研人员检测到了抗体的不同过程的动态变化，并用于追踪淋巴细胞成熟过程以及在不同年龄组之间的差异。最近，科研人员用这项技术检测各种人类疾病。例如，检测各种白血病微小残留病变，他的灵敏度较传统的流式细胞分析法更灵敏，更可靠。这种方法也用于研究免疫系统癌症，传染性疾病如登革热，和自身免疫疾病特别是类风湿性关节炎。尽管免疫组库测序技术在人类基础研究领域中已经有广泛应用，但这种技术在其他模式生物的使用非常有限，仅限于小鼠和斑马鱼。猕猴是一种重要的动物模型，尤其是对人类疾病的研究。超过70种传染病的研究都在恒河猴模型中进行，特别是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，结核病(TB)和疟疾。因此，建立对恒河猴TCRβ进行大规模测序的方案对构建该物种分析模型十分必要。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组、高通量测序方法及应用。第一方面，本专利技术提供了一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列。本专利技术通过针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)设置至少26条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置至少13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出目的链的PCR产物，获得高通量测序文库。本专利技术采用至少13条下游引物序列与所述至少26条上游引物序列随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增TCRβ区。本专利技术针对TCR所有的64类V和13类J基因家族进行了比对分析，26条上游引物序列针对TCR的CDR3区上游(即FR3区)，13条下游引物针对J基因，扩增TCR的CDR3区。优选地，所述的上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列，所述下游引物的为3’端比SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列；所述上游引物或下游引物多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。本专利技术所述的与设计目的TCR互补的碱基是指：针对恒河猴TCR的可变区V区(variable)或针对TCR的连接区(joining)J区设计引物。第二方面，本专利技术提供了一种检测恒河猴T细胞免疫组库的高通量测序方法，包括如下步骤：提取恒河猴基因组DNA或总RNA；采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，进行多重PCR反应；将所得多重PCR产物进行高通量测序；其中，所述开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列。优选地，所述多重PCR反应的体系中，26条上游引物等摩尔混合；13条下游引物等摩尔混合。优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1～3ug/50ul体系。优选地，所述多重PCR反应程序为：优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bp的DNA片段。优选地，所述的上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列，所述下游引物的为3’端比SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列多或少1～3个碱基的核苷酸序列；所述上游引物或下游引物多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。本专利技术提供的TCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的TCR序列，有利于TCR序列的多态性程度分析及TCRCDR3区长度多态性分布分析。优选地，所述T淋巴细胞受体(TCR)待测序列为采用RNA试剂盒提取人外周血单个核细胞的总RNA或者获得的基因组DNA。总RNA样品需要先进行逆转录，再进行多重PCR。第三方面，本专利技术提供了一种构建恒河猴T细胞免疫组库的方法，包括：提取恒河猴基因组DNA或总RNA；采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，进行多重PCR反应；将所得多重PCR产物进行高通量测序；生物信息学分析，对高通量测序结果进行定量分析；其中，所述开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列。在高通量测序平台的基础上，通过对恒河猴TCR基因免疫组库进行全面的生物信息学分析，获得了TCR在VDJ重组时的基因偏好性(usagepatterns)，基因组合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，其特征在于，包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列，所述13条上游引物为如SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:39所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，其特征在于，包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，所述13条下游引物为如SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列。2.一种检测恒河猴T细胞免疫组库的高通量测序方法，其特征在于，包括如下步骤：提取恒河猴基因组DNA或总RNA；采用开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组，进行多重PCR反应；将所得多重PCR产物进行高通量测序；其中，所述开发恒河猴T细胞免疫组库的引物组包括26条上游引物和13条下游引物，其中，所述26条上游引物为如SEQIDNO:1～SEQIDNO:26所示的核苷酸序列，所述13条下游引物为如SEQIDNO:27～SEQIDNO:39所示的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的检测恒河猴T细胞免疫组库的高通量测序方法，其特征在于，所述多重PCR反应的体系中，26条上游引物等摩尔混合；13条下游引物等摩尔混合。4.如权利要求2所述的检测恒河猴T细胞免疫组库的高通量测序方法，其特征在于，所述多重PCR反应的体系中...
【专利技术属性】
技术研发人员：李周芳，贺建奎，童寅，张萌，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。