一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法技术

本发明专利技术公开了一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明专利技术包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。本发明专利技术步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用。

A method for studying the humoral immune response and cellular immune response of Cordyceps militaris polysaccharides

The invention discloses a method for response and cellular immune responses of humoral immune response to the body of a Cordyceps militaris Polysaccharide. The invention comprises the following steps: (1) the Cordyceps militaris Polysaccharide Extracts preparation; (2), experimental animal and immunity; (3) and IgG were investigated; (4), IgG subclass determination; (5), lymphocyte transformation test; (6), detection of cytokine mRNA; (7) statistical analysis, draw the conclusion. The invention has the advantages of simple procedures, easy to use, can be speculated that cordyceps polysaccharides can effectively improve the response and the cellular immune response of humoral immune response, Cordyceps Polysaccharide on Th1 and Th2 cytokines have increased, suggesting that the immune response mechanism of organism may be activated, in addition, Cordyceps polysaccharide may have a role of regulation of humoral and cellular immune responses to balance.

【技术实现步骤摘要】
一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法
：本专利技术涉及生物免疫领域，更具体地说涉及一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。
技术介绍
：家蚕是世界上饲养最多的昆虫，利用家蚕幼虫栽培北虫草有着丰富的可利用资源。再者，近几年蚕桑业也面临着严重的滑坡，如何提升蚕桑产业的附加值迫在眉睫，利用家蚕幼虫栽培北虫草不仅成本较低，而且营养价值也不低于野生的冬虫夏草，社会与经济效益显著，就一张蚕种的产值来算一笔经济账，一般春蚕饲养1张蚕种，张种产量100斤左右，茧价2000元/担，一张种收入2000元，用一张五龄幼虫蚕种栽培北虫草，可得到干体蚕虫草14斤左右，以每斤500元计算，一张种的产值7000元，是丝茧育的3.5倍，可大大的提升蚕桑产业的产出值。
技术实现思路
：本专利技术的目的就是针对现有技术的不足，而提供一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。本专利技术具有步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用的优点。本专利技术的技术解决措施如下：一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本专利技术包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。上述技术方案中，所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。上述技术方案中，所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。上述技术方案中，所述IgG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μgOVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封闭液(0.01mol/L,pH7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEMICONInternationalInc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/LH2SO450μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。上述技术方案中，所述IgG亚类测定的步骤包括：在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/LH2SO450μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。上述技术方案中，所述淋巴细胞转化试验的步骤包括：将小鼠脱颈椎处死，75％酒精液浸泡5-10min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1mLHank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10mL离心管；1500rpm离心10min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5×106/mL，按100μl/孔的量加入96孔细胞培养板中；用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5μg/mL，ConA终浓度为7.5μg/mL，设阴性对照和空白对照)；37℃、5％CO2培养箱中培养48h；在培养结束前4h，每孔加入50μlMTT(2mg/mL)；然后将培养板取出，离心(1500rpm，10min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干；每孔加入150μl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570nm波长酶标仪检测OD值；计算淋巴细胞刺激指数(Stimulationindex，SI)：SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。上述技术方案中，所述细胞因子mRNA检测的步骤包括：(a)、脾淋巴细胞体外刺激；(b)、TotalRNA提取；(c)、反转录；(d)、引物及探针设计；(e)、Real-timePCR反应体系及条件；(f)、相对定量计算方法。本专利技术的有益效果在于：本专利技术步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用。附图说明：图1为本专利技术研究技术路线示意图；图2为不同剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG抗体水平对照示意图；图3为不同剂量虫草多糖佐剂组与阳性对照组小鼠血清IgG1和IgG2a抗体水平对照示意图；图4为淋巴细胞转化试验结果示意图；图5为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IFN-γ表达水平示意图；图6为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-12表达水平示意图；图7为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-10表达水平示意图；图8为北虫草多糖粗提物佐剂组有效诱导IL-4表达水平示意图。具体实施方式：以下结合具体实施例来对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术所要求保护的范围并不局限于实施方式所涉及之范围。实施例：一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本专利技术包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。所述Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本专利技术包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。

【技术特征摘要】
1.一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。2.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。3.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。4.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述IgG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μgOVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封闭液(0.01mol/L,pH7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEMICONInternationalInc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/LH2SO450μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。5.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：占鹏飞，冯建琴，费建明，李玉峰，施国方，黄秀娣，
申请(专利权)人：湖州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33