一种虫草真菌胞内多糖复合物的制备及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药技术领域。研究了一种虫草真菌胞内多糖的制备方法及其抗肿瘤、抗氧化活性的应用，用于研制开发药品，保健品和功能食品。虫草真菌经液体培养后所得到的菌丝体烘干磨碎，用热水提取法提取胞内多糖（ＰＳ），得率为６～７％，其中多糖含量为８０．１１％。获得的提取物具有较强的抗肿瘤、抗氧化活性，可用于药品和保健食品的基料，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、预防心血管疾病等功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种虫草真菌(Tolypocladium sp.)胞内多糖的制备方法及其抗肿瘤、抗氧化活性的应用。
技术介绍
冬虫夏草是我国一种名贵的强壮滋补类中药，作为一种既可药用又可食用的高级滋补品，对老、少、病、弱、虚者皆宜服用，无任何副作用。由于其严格的寄生性和特殊的生长地理环境，天然虫草资源越来越少，价格十分昂贵。近来已有研究报道，人工培养的虫草真菌活性成分与天然虫草非常相似，具有广泛的生物活性作用，目前已有数种人工培养的虫草真菌开发成产品。因此，采用人工培养的虫草真菌来代替天然虫草已成趋势。虫草多糖是虫草所含生理活性物质中最重要、最丰富的类群之一，其特点为生理活性强，适应面广，可用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化、糖尿病、慢性疲劳综合症、慢性肝炎、肝硬化、恶性肿瘤以及减轻肿瘤放疗和化疗后的毒副作用。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种虫草真菌胞内多糖的制备方法及其抗肿瘤、抗氧化活性的应用。本专利技术方法简便，所得虫草真菌胞内多糖得率高、活性显著、周期短、无毒、安全。本专利技术技术方案1、以本实验室优化得到的液体发酵培养基培养虫草真菌，经过滤收集菌丝体。烘干，磨碎，用热水浸提法提取其胞内多糖复合物PS，得率为6％～7％。2、采用H22小鼠肝癌模型测定胞内多糖复合物对肿瘤生长的作用和抗氧化作用，如瘤重，肝、脑、血清脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及其超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力。该多糖复合物可显著抑制肿瘤的生长，提高肝、脑过氧化物酶的活力，降低脂质过氧化物的产生。本专利技术的有益效果本专利技术所述的虫草真菌胞内多糖复合物具有较强的抗氧化能力，同时对肿瘤的生长具有显著的抑制作用。目前的研究表明机体内自由基含量与肿瘤的关系非常密切，肿瘤的发生、促进和发展三个阶段中，均有自由基的催化、推动。因此，利用抗氧化物质消除机体内过多的自由基，可以在一定程度上抑制肿瘤的发生、促进和发展。SOD和GSH-PX是体内重要的抗氧化酶，可使体内过多的O2-、·OH、H2O2等毒性自由基转变为低毒性物质，这对保护机体免受自由基的损害非常重要。SOD和GSH-PX同时升高，可有助于细胞清除活性氧损伤的能力。MDA是细胞膜脂质过氧化物的终产物，且本身也可交联蛋白质、磷脂上的氨基，使细胞可塑性降低，导致细胞膜损伤。本实验室所研究制备的虫草真菌胞内多糖能显著提高小鼠血清、肝、脑组织中SOD和GSH-PX的活性，降低小鼠血清、肝、脑中MDA的含量。由此可见，本实验室研究制备的虫草真菌胞内多糖复合物具有较好的抗肿瘤和抗氧化活性，可用于制备各种预防和治疗肿瘤的药物和保健品，以及抗衰老保健食品，其活性显著、价格低廉、生产简便、无毒、安全。具体实施例方式1.虫草真菌的培养固体培养基(PDA)1000ml马铃薯浸出液(取马铃薯切片20g于蒸馏水1000ml中煮沸30min)，20g葡萄糖，15g琼脂，pH7.0. 液体培养基(1L)蛋白胨5g，酵母粉2g，葡萄糖40g，KH2PO41g，MgSO40.5，pH7.0。种子液培养100ml锥形瓶中装25ml虫草真菌液体培养基，挑取已活化的PDA平板上菌落边缘的琼脂菌丝块(0.Scm×0.5cm)接种至液体培养基中培养，于摇床25℃，180r/min培养4天。扩大培养100ml锥形瓶中装25ml虫草真菌液体培养基，每瓶接种2.5ml种子液，于摇床25℃，180r/min培养4天。2.胞内多糖复合物PS的制备通过过滤收集菌丝体，将菌丝体用蒸馏水清洗3遍后置于50℃烘箱中烘干，磨碎。取20g磨成细粉的干菌丝体加入400ml蒸馏水中煮沸3个小时，3000r/min离心10min，收集上清液，重复3次后合并上清液。将得到的上清液浓缩至体积小于100ml，冷却至室温后加3倍体积95％乙醇沉淀，4℃过夜。然后再以3000r/min离心10min收集沉淀，蒸馏水溶解沉淀后离心，取上清液进行透析，离心去不溶物，取上清液再次用无水乙醇沉淀，自然干燥，即获得胞内多糖复合物PS，得率为6％～7％。，其中多糖含量为80.11％。3.动物实验雄性ICR小鼠30只，随机分成4组，每组6只。正常组不接种肿瘤，给等量生理盐水；肿瘤未治疗组不给药，给生理盐水；胞内多糖低剂量组(PSl)(100mg/Kg)；胞内多糖高剂量组(PS2)(200mg/Kg)。每天固定时间给药一次并记录小鼠活动情况，胞内多糖采用灌胃方式给药，每次灌胃0.2ml/只。给药7天后，每只小鼠右腋下皮下接种0.1ml浓度为1×107个/ml的H22肿瘤细胞。继续给药7天，于最后一次给药后24h测小鼠体重，眼球摘除放血法处死小鼠，离心收集血清用于测定MDA含量和SOD活力。剥离皮下肿瘤并称重，在冰台上迅速取出肝、脑组织用铝箔包好立即放置-80℃保存，用于测定肝、脑脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及其SOD、GSH-PX活力。4.抗氧化酶活性及脂质过氧化物测定用黄嘌呤氧化酶法测定SOD、二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH-PX。用硫代巴比妥酸法测定MDA。胞内多糖复合物PS对小鼠肿瘤生长的作用结果见表1。与肿瘤未治疗组相比，治疗组的平均肿瘤重量均有所下降，其中PS1组对皮下H22肿瘤的生长有显著抑制作用。表1 胞内多糖复合物对小鼠皮下H22肿瘤重量的影响(x±s) *P＜0.05，与肿瘤未治疗组相比较。胞内多糖复合物对小鼠肝、脑、血清SOD活力的影响见表2。在肝、脑组织中，肿瘤未治疗组SOD活力显著低于正常对照组水平；PS1、PS2组SOD活力相对于肿瘤未治疗组有显著升高，脑组织PS2组SOD活力较正常小鼠体内SOD活性水平显著升高，其余各组较正常小鼠体内SOD活性升高但无显著性差异。在小鼠血清中，肿瘤未治疗组SOD活力与正常对照组相比无显著性降低；PS1、PS2组SOD活力相对于正常对照组、肿瘤未治疗组均有显著性升高。表2 胞内多糖复合物对小鼠肝、脑、血清SOD活力的影响(x±s) #P＜0.05，与正常对照组比较。*P＜0.05，**P＜0.01与肿瘤未治疗组相比较。胞内多糖复合物对小鼠肝、脑GSH-PX活力的影响见表3。在小鼠肝、脑组织中，肿瘤未治疗组GSH-PX活力相对于正常对照组显著降低；PS1、PS2组中除PS1组中脑组织GSH-PX活力较肿瘤组无显著升高外，肝、脑组织GSH-PX活力相对于肿瘤未治疗组均有显著增加，但是与正常对照组相比无显著性差异。表3 胞内多糖复合物对小鼠肝、脑GSH-PX活力的影响(x±s) #P＜0.05，与正常对照组比较。*P＜0.05，**P＜0.01与肿瘤未治疗组相比较。胞内多糖复合物对小鼠肝、脑、血清脂质过氧化产物MDA的影响见表4。在小鼠肝、脑组织和血清中，肿瘤未治疗组MDA值较正常对照组有所升高，其中脑组织中MDA有显著性提高；与肿瘤未治疗组相比，PS1、PS2肝脏组织中MDA有极显著性降低，在PS2脑组织中有显著性降低，但是在血清中无显著性差异。表4 胞内多糖复合物对小鼠肝、脑、血清脂质过氧化产物MDA的影响(x±s) #P＜0.05，与正常对照组比较。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与肿瘤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种虫草真菌胞内多糖复合物的制备方法，其特征在于：（１）虫草真菌发酵的液体培养基成分为１Ｌ培养基中含蛋白胨５ｇ，酵母粉２ｇ，葡萄糖４０ｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］０．５，ｐＨ７．０；（２）虫草真菌的培养条件为 ２５～２８℃，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床震荡培养３～４天；（３）虫草真菌胞内多糖复合物的制备，通过过滤收集菌丝体，将菌丝体用蒸馏水清洗３遍后置于５０℃烘箱中烘干，磨碎，取２０ｇ磨成细粉的干菌丝体加入４００ｍｌ蒸馏水中煮沸３个小时，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液，重复３次后合并上清液，将得到的上清液浓缩至体积小于１００ｍｌ，冷却至室温后加３倍体积９５％乙醇沉淀，４℃过夜，然后再以３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集沉淀，蒸馏水溶解沉淀后离心，取上清液进行透析，离心去不溶物，取上清液再次用无水乙醇沉淀，自然干燥，即获得胞内多糖复合物ＰＳ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟云，陈佳萍，陈伟，芦婷婷，李静，郑翌，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]