本发明专利技术涉及一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术通过采用化学方法连接抗体和可降解的纳米颗粒，使一个纳米颗粒上同时连接两种或两种以上多个抗体分子，其中一种抗体能够特异结合免疫细胞，另一种或几种抗体可以特异结合肿瘤细胞，从而起到增强免疫细胞靶向特异杀伤肿瘤细胞的效果。相比CAR-T免疫细胞疗法，采用本发明专利技术的双特异性抗体具有生物可降解，无基因重组，副作用小，安全性高，成本低，可针对不同肿瘤细胞组合对应的特异性抗体，使用方便等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫医学领域，尤其涉及一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
2008年《新英格兰医学杂志》报道I例晚期黑色素瘤的免疫治疗取得成功，该患者为全身多处转移病例，经自身CD4+T细胞治疗后所有病灶消失，经随访26个月长期生存。2010年FDA批准Dendreon Corporat1n (丹德里昂公司)自体免疫细胞治疗技术用于前列腺癌临床应用，2011年的诺贝尔医学奖也授予了从事肿瘤免疫治疗相关的3位科学家，预示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。近几年，利用基因修饰诱导的T细胞免疫治疗肿瘤取得了良好的疗效，为肿瘤的免疫细胞治疗发展指明了新的方向。预示了免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。免疫细胞治疗技术经历了 LAK、CIK、DC-CIK的发展历程，并朝着抗原负载的DC诱导T细胞(DiKat)、基因修饰的DC诱导T细胞(AV/LV-DC-CTL)以及基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)方向飞速发展，目前由诺华公布的针对CD19靶点的B淋巴瘤临床实验结果宣布完全有效率达到了 93%，更是突出了免疫细胞疗法抗癌的前景。然而CAR-T因其细胞复杂的制备过程，高额的费用也同时让人望而却步，其每个疗程的成本预计是50万美元，并且目前也只是针对CD19阳性B淋巴瘤体现了良好疗效，其局限性显而易见。如何研发一种可以加强免疫细胞疗法的特异性和有效性，并具有简单、方便使用等优点的免疫细胞治疗技术是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双特异性抗体及其制备方法和应用，特别是一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体及其制备方法和应用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案:第一方面，本专利技术提供了一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体，所述的双特异性抗体包括结合在效应T细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。本专利技术中所述的第二抗体部分可以是一种或多种抗体，其均可以结合靶细胞。本专利技术中，所述第一抗体部分和第二抗体部分通过纳米材料进行连接。其连接方式采用利用纳米颗粒表面的羧基和抗体的氨基连接。“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。本专利技术以免疫细胞靶向治疗为原则，利用抗体的特异性结合能力，将能够特异识别肿瘤细胞和肿瘤杀伤细胞的抗体用临床可用的降解的纳米材料连接起来，从而形成双特异性抗体。与抗癌单抗相比较，大多数抗癌单抗作为治疗疾病的药物主要基于其固有的生物学功能包括:补体介导的细胞毒性作用(CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)凋亡诱导、调理吞噬等。本专利技术的双特异性抗体是其一边特异性识别并结合肿瘤细胞，另一边识别并结合杀伤性T淋巴细胞，从而帮助T细胞识别肿瘤细胞，并拉近肿瘤细胞和杀伤性T淋巴细胞之间的物理距离，方便T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞，起到加强免疫细胞疗法的特异性和有效性的目的。本专利技术中所述纳米材料为生物可降解纳米材料。本专利技术中所述的纳米材料通常是以纳米颗粒的形式而存在，选自常规的可降解的纳米材料，例如可以是聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚己内酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己内酯共聚物中的任意一种或至少两种的混合物，优选但不限于此。本专利技术采用纳米材料具有缓释、良好的生物相容性等优点，例如PLGA是美国FDA批准的药用辅料，具有良好生物相容性和生物可降解性，无毒、无刺激性，强度高，易加工成型，在生物题内经酶解最终分解产物为水合二氧化碳，置入体内后3-6个月可完全吸收。本专利技术中，所述靶细胞是B细胞、癌细胞或病原体细胞等。优选地，所述靶细胞上表达的抗原为CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、Mucl、Muc 16, HER2、HER3、EGFRv II1、VEGFA、CEA、GPA33、GP100、ANG2、LI CAM、ROR-1、CS 1、MI CA 或MICB中的任意一种。优选地，所述效应T细胞上表达的抗原为⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶6、⑶8、⑶25、⑶28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69 或 CD90 中的任意一种。第二方面，本专利技术还提供了如本专利技术第一方面所述的双特异性抗体的制备方法，其包括将纳米材料与第一抗体部分和第二抗体部分连接。本专利技术中所述的双特异性抗体的制备方法，其包括以下步骤:(I)纳米材料的制备、收集和活化；(2)将步骤(I)得到的纳米材料与第一抗体部分和第二抗体部分的混合物进行连接。本专利技术的步骤(I)中，所述纳米材料的制备包括:利用溶剂将纳米材料完全溶解，搅拌，加水，形成均匀的乳浊液。优选地，所述纳米材料为聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸、聚己内酯、聚丁二醇丁二酸酯、聚苯胺、聚碳酸酯、乙丙交酯共聚物或乙交酯己内酯共聚物中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述溶剂为丙酮、丁酮、甲醇、乙醇或异丙醇中的任意一种或至少两种的混合物。优选地，所述纳米材料的收集包括:离心收集制备的纳米材料，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米材料。优选地，所述纳米材料的活化包括:利用1-lOmg/mL的1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDS)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶剂室温活化纳米材料0.5_5h。本专利技术的步骤(2)中，所述连接包括:将活化后的纳米材料离心收集，然后用连接反应液洗涤纳米材料I次，将需要连接的第一抗体部分和第二抗体部分等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应0.5-5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液(D-PBS)中放4°C保存备用。本专利技术中所述双特异性抗体的制备方法，具体包括以下步骤:(I)纳米材料的制备:利用丙酮将纳米材料完全溶解至浓度为5?30mg/mL，按照丙酮和去离子水1:4的体积比，在500?1500rpm/min磁力搅拌的状态下将纳米材料与丙酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至丙酮挥发；(2)纳米材料的收集:8000?15000rpm/min离心收集制备的纳米材料，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米材料；(3)纳米材料的活化:利用I?10mg/mL的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶剂室温活化纳米材料0.5?5h ;(4)纳米材料连接抗体:将活化后的纳米材料离心收集，然后用0.1Μ、ρΗ = 8.0的杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料I次，将需要连接的第一抗体部分和第二抗体部分等量混合加入到连接反应液，然后用含有所述第一抗体部分和第二抗体部分的连接反应液重悬纳米材料，室温连接反应0.5?5h，反应结束后离心收集纳米材料，用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤纳米材料2次，然后再重悬到杜氏磷酸盐缓冲溶液中放4°C保存备用。第三方面，本专利技术还提供了如第一方面所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或诊断肿瘤的药物中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能联合免疫细胞增强肿瘤靶向杀伤能力的双特异性抗体，其特征在于，其包括结合在效应T细胞上表达的抗原的第一抗体部分和结合在靶细胞上表达的抗原的第二抗体部分。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于浩洋，李正成，苏静，
申请(专利权)人：苏静，
类型：发明
国别省市：广东;44
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