本发明专利技术涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗技术，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备，本发明专利技术的制备方法，包括以下步骤：步骤1，外周血采集单状核细胞；步骤2，DC和T细胞分离；步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；步骤4，CIK制备；步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备。
技术介绍
肿瘤发病率逐年上升，传统的手术、放疗、化疗三大模式中，化疗是唯一的全身治疗手段，但化疗的有效率低(25-30%)、副反应大、耐药性、只对分裂期细胞有效、严重的免疫抑制、对肿瘤干细胞无效六大缺陷，严重限制了临床应用。“细胞免疫治疗”作为一种全新的全身治疗新技术应用于临床，并获得了有效率高、副反应小的良好效果，被越来越多的肿瘤病患所接受，因而成为肿瘤的第四大治疗模式。目前国内外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技术进行肿瘤的细胞免疫治疗，临床疗效虽远高于化疗，但回输的效应细胞在体内存留时间短，有效率低仍是目前亟待解决的瓶颈问题。基础研究证实，肿瘤一旦形成，就会形成“肿瘤微环境”，产生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-i3、IL-6等，同时调节性T淋巴细胞(Treg)水平大幅升高，结果导致病人本身的免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，致使肿瘤无限制生长，我们称之为肿瘤的 “免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要这些免疫抑制因素存在，体外制备的效应细胞回输体内后很快被抑制，体内的存留时间只有3-5天，严重影响了效应细胞对肿瘤的杀伤效应。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破肿瘤免疫耐受、提高免疫治疗疗效的关键。细胞免疫治疗方法很多，上世纪初就出现了应用LAK细胞治疗肿瘤的技术，但由于有效率低，疗效不确切而被放弃。以后，人们逐一探讨了 NK细胞、TIL细胞、CTL细胞、 DC疫苗等临床应用的可行性，均因疗效的不确切性而未被临床认可。本世纪初，人们发现 DC-CIK细胞具有强大的肿瘤杀伤功能，并能在体内产生免疫记忆，有利于持续的免疫杀伤， 而且副反应小、安全性高，因而国内外临床已广泛推广应用至今。DC-CIK技术的方法是从肿瘤病人外周血获取单状核细胞，体外分离出DC细胞 (贴壁)和T细胞(悬浮)。贴壁的DC细胞内加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集备用。悬浮的T细胞加入INF-γ冲击，然后加入CIK细胞因子，每48小时扩增一次。第5-7天，将成熟DC和CIK细胞混合培养8-10天获得DC-CIK，移至含有2. Og白蛋白的0. 9%生理盐水中制备成DC-CIK效应细胞制剂，直接静脉输注治疗(参照专利200510112381 )。上述方法存在的问题是①效应细胞制剂肿瘤杀伤力强但特异性相对差；②直接回输后，在肿瘤微环境中IL-10、TGF-i3及Treg的免疫抑制下，效应细胞在体内的存留时间短(3-5天)，杀伤效率低；③所产生的免疫记忆也被抑制而不能发挥免疫激发功能，因而，临床疗效有限。本专利技术在于提供一种在干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受基础上，DC-CIK-CTL 高效特异性细胞免疫治疗的新技术，解决了现有DC-CIK技术存在的特异性差、体内存留时间短、杀伤效率低等瓶颈问题。本专利技术的方法是外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞经过INF-γ冲击后，应用CIK细胞因子扩增至第7天，半数移瓶加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数继续CIK扩增，至第10天收集CIK和CTL效应细胞， 混合移入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0. 9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，2次/日，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。本专利技术还发现，单次应用小剂量替加氟或环磷酰胺(CTX)，能够有效的降低肿瘤病人外周血调节性T淋巴细胞(Treg)的比率，同时能够降低外周血中IL-10和TGF-β的量， 但并不能有效的杀伤肿瘤细胞。因而我们假设，尽管小剂量CTX的应用不能起到治疗肿瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF- β含量，恰恰能够达到消除肿瘤微环境中重要的免疫抑制因素，在此基础上实施细胞免疫治疗，可以有效的延长回输的效应细胞在体内的存留时间，强化细胞免疫对肿瘤的杀伤效应，获的更高的临床疗效。基于以上发现，我们建立了本专利技术，即首先应用小剂量替加氟和CTX对肿瘤病人进行预处理，然后给予DC-CIK-CTL高效特异性杀伤细胞，进行细胞免疫治疗。经过实验室研究、动物实验研究及临床试验研究，获得大量研究数据，证实了该技术的有效性和安全性。目前临床应用替加氟和CTX，目的是化疗，用量分别是替加氟800-1000mg，总量 20g-40g —疗程，CTX 500-1000mg/m2,每周1次，此剂量是化疗的常规剂量，具有较大的副反应，而小剂量虽可降低副反应，但达不到化疗目的。本技术应用小剂量替加氟和CTX，目的不是化疗，而是降低外周血Treg、IL-10和 TGF- β的含量，达到干扰肿瘤微环境，打破肿瘤免疫耐受的疗效，为随后进行的细胞回输治疗创造环境，因而目的和用途是不同的。本技术应用了替加氟和CTX复合制剂，对肿瘤病人进行预处理，使外周血Treg、 IL-10和TGF-β等免疫抑制因素显著降低，在此基础上，回输的效应细胞在体内的存留时间显著延长，达到20-30天，肿瘤的杀伤效率明显提高，使临床总体疗效提高到68%。所以， 本技术是国际国内最新研究成果，也是最合理的临床治疗模式。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于解决目前DC-CIK方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的瓶颈问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。为保证上述技术的实施，本专利技术提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，本专利技术的制备方法，包括以下步骤步骤1，外周血采集单状核细胞； 步骤2，DC和T细胞分离； 步骤3，DC成熟和DC疫苗制备； 步骤4，CIK制备； 步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环 6000-8000ml，采集单状核细胞120_140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转 /分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清(方法加入10%葡萄糖酸钙2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清)，4°C冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液(FicOll，1.077)15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层(单状核细胞)。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混勻，离心1500rpmX 10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混勻，离心IOOOrpmX 5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数(细胞总数量6-10X109)。其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。 将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在IX IO7个/ml，加入终浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡建辉，马云龙，杰弗里·梅德因，
申请(专利权)人：蔡颖，
类型：发明
国别省市：
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