本发明专利技术公开了产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其产生的单克隆抗体。所述杂交瘤细胞株由SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。所述的抗体，能够用于人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋的免疫检测。藉此能够开发出人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋的免疫检测试剂，用于诊断或检测急性肾损伤等疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药工程
，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体。
技术介绍
肾损伤是临床上各种危重疾病最常见的并发症之一。近几十年来虽然对肾损伤病理生理和发病机制的研究以及临床治疗方法已经有了很大进步，但其发病率和死亡率仍然居高不下。已经明确，早期治疗对肾损伤的逆转十分重要，而早期诊断是指导临床及时治疗的关键。目前，临床上常用的经典肾损伤生物化学标志物主要有血尿素氮、血肌酐、血胱抑素C。尿素是人体蛋白质代谢的重要终末小分子代谢产物，其浓度并不完全依赖于肾功能，当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时，血尿素浓度才迅速升高，只能作为粗略估计肾功能的指标；肌酐是肌酸代谢的终末产物，与尿素相比，其受肾外因素影响小，能较好的指示肾脏功能。但与血尿素一样，血肌酐对肾脏储备功能的损失不敏感；有研究表明血胱抑素C在肾损伤发生12小时才上升，此时肾功能已经受到不可逆损伤，增加了肾损伤的死亡率。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)在急性肾损伤极早期就显著升高，其敏感性高，窗口期短，作为肾损伤的生物学预警和诊断指标受到广泛关注。NGAL是中性粒细胞特异性颗粒中发现的一种25Kd的小分子分泌型蛋白。广泛分布于成人骨髓、子宫、前列腺、唾液腺、胃、阑尾、结肠和气管以及胎儿脾脏和肺组织中。这种25kDa的蛋白质由198个氨基酸组成，前20个氨基酸为前导序列，NGAL是脂质运载蛋白(lipocalin)超家族的新成员，能够结合并运输疏水性小分子，参与体内抗炎作用并可能与肿瘤存在密切联系。2003年Mishra J等观察到缺血再灌注损伤后的小鼠肾脏和顺钼诱导的中毒性肾损害中，小鼠尿液中NGAL显著增高，2011年Barasch研究小组在NatureMedcine上报道了用Luciferase-2和mCherry双萤光报告基因在NGAL启动子和其5’ UTR驱动下的knock in小鼠模型的实验结果，揭示了缺血性和细胞毒性肾损害时NGAL基因表达活性在肾组织中的Henles管和集合管的上皮细胞呈剂量依赖性的显著变化。说明肾损伤时尿中NGAL主要来自肾组织，而不是来自正常时也低表达NGAL的中性粒细胞、肝细胞、呼吸道和肠道等上皮细胞。说明NGAL在肾损伤诊断中有重要的应用价值。实现NGAL免疫检测的关键问题是如何获得其单克隆抗体及多克隆抗体以及作为免疫检测的抗原标准品。根据生物信息学预测，NGAL蛋白在86位氨基酸可能有糖基化，为能最好地接近天然蛋白的结构和功能，通过基因工程在293细胞中表达适用于免疫学检测工作标准品的重组NGAL蛋白，为下一步NGAL单克隆抗体和多克隆抗体的制备提供抗原，并用于NGAL特性的研究。N GAL对于肾损伤的早期诊断更具有特异性和敏感性，有望成为理想的肾损伤早期诊断生化指标。免疫检测技术是基于抗原一抗体反应的原理对待测物(抗原/抗体)进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、便捷等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。构建基于免疫检测技术的NGAL检测体系对于肾脏疾病早期诊断、人类健康等都具有重要的意义，同时具有较大的社会意义和经济价值。目前市场上出售的用于检测NGAL的酶联免疫(ELISA)试剂盒，均采用国外进口 NGAL抗体，价格昂贵，且为科研用试剂盒，难以大面积进行临床应用。因此，制备高特异性的NGAL特异性单克隆抗体成为迫切需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供两株产生抗人NGAL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术所提供的产生抗人NGAL的单克隆抗体的杂交瘤细胞株均保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)Jia:中国湖北省武汉市武汉大学，邮编:430072，保藏日期为2012年12月26日，保藏号分别为CCTCC N0.C2012197和CCTCC N0.C2012198，分类命名分别为杂交瘤细胞株NGAL (1-F2)和杂交瘤细胞株NGAL (1-G2)，在本申请中分别命名为1-F2和 1-G2。杂交瘤细胞株1-F2和1-G2均由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。本专利技术还提供一种由杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体，该单克隆抗体的亚类属于IgGl。本专利技术还提供一种由杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体。该单克隆抗体的亚类属于IgGl。本专利技术还提供杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体和/或杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体制备肾损伤诊断或检测制剂中的应用。本专利技术还提供一种用于诊断或检测肾损伤的试剂盒，其包含杂交瘤细胞株1-F2所产生的单克隆抗体和/或杂交瘤细胞株1-G2所产生的单克隆抗体。 本专利技术具体通过下述技术方案完成本专利技术的目的:1.NGAL重组蛋白的制备:从GENEBANK中获得人NGAL编码序列，通过扩增人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL的基因片断，将目的基因与真核表达载体连接，构建真核表达重组质粒。将重组质粒稳定转染到293细胞中，表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到高纯度的NGAL重组蛋白。2.通过生物信息学预测，NGAL蛋白86位氨基酸有明显糖基化，为能得到最好的能够识别天然蛋白的特异性单克隆抗体，以方案I中得到的NGAL重组蛋白作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对NGAL的。3.建立NGAL的ELISA检测体系:利用已制备的抗NGAL抗体作为捕获抗体和检测抗体，以NGAL重组蛋白作为检测抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测天然NGAL的配对抗体并以此成功建立了检测NGAL的双抗体夹心ELISA方法。本专利技术通过杂交瘤技术，制备了抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-F2和1_G2，能分泌相应的NGAL特异性单克隆抗体，能进行成功配对和检测天然血清，初步建立了检测NGAL的双抗体夹心ELISA方法。为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明图1为NGAL基因逆转录PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。其中，M为DNAMarker ;1_5 分别为五个退火温度 60°C、62°C、64°C、66°C、68°C。图2为pcDNA3.1-NGAL用EcoR I及Acc65 I双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果分析图。其中，M 为 DNA marker ;泳道 I 为 pcDNA3.1，泳道 2 为 pcDNA3.1-NGAL0图3为重组NGAL蛋白表达Western blot鉴定图；其中，I为细胞提取蛋白；2为细胞培养上清。图4为重组NGAL蛋白纯化图。其中I为紫外吸收曲线，2为溶液电导，3为纯化抗体浓度，F1、F2、分别为指不同时间蛋白纯化出现的吸收峰。图5为纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC?NO.C2012197。
【技术特征摘要】
1.一种产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC N0.C2012197。2.—种产生抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC N0.C2012198。3.如权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，由SEQID NO:1所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后，小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。4.如权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的基因序...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈安，胡川闽，何莹，易维京，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
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