一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY及其应用制造技术

一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13096。此细胞株分泌的单克隆抗体，对氟尼辛葡甲胺具有较好的特异性和检测灵敏度（IC

【技术实现步骤摘要】
一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY及其应用
本专利技术涉及一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
氟尼辛葡甲胺(flunixinmeglumine，FM)是一种新型的、非甾体类动物专用的解热镇痛药物，其中,flunixin（氟胺烟酸，分子式C14H11F3N2O2）是结构特殊的一类非甾体类抗炎镇痛解热药,meglumine（葡甲胺，分子式C7H17NO5）主要起稳定剂的作用，二者以固定比例（1∶1，即一个氟胺烟酸分子结合一个葡甲胺分子）出现，即为FM。兽医临床上常用于缓解马的内脏绞痛、肌肉与骨骼紊乱引起的疼痛及抗炎；牛的各种疾病感染引起的急性炎症的控制，如蹄叶炎、关节炎等，另外也可用于母猪乳房炎、子宫炎及无乳综合症的辅助治疗。齐鲁动物保健品有限公司独立研制并申报的氟尼辛葡甲胺已于2007年6月1日被农业部批准为国家三类新兽药，证书编号为（2007）新兽药证字23、24号。EMEA（欧洲药品管理局）规定了氟尼辛葡甲胺在牛肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中的限量分别为20、30、300和100μg/kg；美国FDA于2002年4月批准的家畜用氟尼辛葡甲胺文件中规定其在牛肝脏和肌肉中的残留限量分别为125及25μg/kg。为了有效监督监测兽医临床上使用氟尼辛葡甲胺的情况，需要寻找一种特异性好、灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的氟尼辛葡甲胺检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对氟尼辛葡甲胺具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立氟尼辛葡甲胺的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案：一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.13096。氟尼辛葡甲胺单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.13096的氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY分泌产生。所述氟尼辛葡甲胺单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中氟尼辛葡甲胺残留的分析检测。本专利技术提供的氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY的制备基本步骤为：1）完全抗原的制备：免疫原FM-BSA的制备：称取2.2mgFM，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.6mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应6-8h（称为A液）。取牛血清蛋白BSA10mg（FM与BSA摩尔比为30︰1），用4mL硼酸缓冲溶液溶解（称为B液）。在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物FM-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原。包被原FM-OVA的制备：称取1.6mgFM，1-乙基碳二亚胺盐酸盐1.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应6～8h（称为A液）。称取5mg鸡卵清白蛋白OVA（FM与OVA摩尔比为30︰1），溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物FM-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原；2）小鼠的免疫：FM-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用FM-BSA完全抗原冲刺免疫（25μg/只，不含佐剂）；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；取高效价低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株；3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY；4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株YY分泌的单克隆抗体，对氟尼辛葡甲胺具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.24ng/mL），为兽用氟尼辛葡甲胺残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株单克隆细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13096，保藏日期2016年10月31日。附图说明图1YY分泌的单克隆抗体对氟尼辛葡甲胺的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将氟尼辛葡甲胺完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对氟尼辛葡甲胺有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株YY的制备（1）完全抗原的制备：称取2.2mgFM，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.6mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.6mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应6-8h（称为A液）。取牛血清蛋白BSA10mg（FM与BSA摩尔比为30︰1），用4mL硼酸缓冲溶液溶解（称为B液）。在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物FM-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原。包被原FM-OVA的制备：称取1.6mgFM，1-乙基碳二亚胺盐酸盐1.9mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温搅拌反应6～8h（称为A液）。称取5mg鸡卵清白蛋白OVA（FM与OVA摩尔比为30︰1），溶解于2mL硼酸缓冲溶液中，在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物FM-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取氟尼辛葡甲胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13096。

【技术特征摘要】
1.一株氟尼辛葡甲胺单克隆抗体杂交瘤细胞株YY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.13096。2.氟尼辛葡甲胺单克隆抗体，其特征在于：它...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，林璐，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32