本发明专利技术公开了一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株2G9A3‑35H11，保藏编号为CCTCC NO:C2015141。本发明专利技术以AHD‑CP与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后得到的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株在体外培养时可大量分泌的抗AHD衍生化产物的特异性抗体，可用于呋喃妥因代谢物的快速、准确免疫检测和免疫分析。
【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
呋喃妥因(Nitrofurantoin，CASNo.67-20-9)，属于硝基呋喃类药物，是一种人工合成的抗菌药，常作为广谱类抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物1-氨基-乙内酰脲(AHD)作为残留标示物判定动物养殖过程是否使用呋喃妥因。目前，AHD残留的检测方法主要有液相-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)，LC-MS/MS法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入和产地准出制度实施后对检测方法时效性的需求。ELISA和GICT是利用抗体与抗原的高特异性、高灵敏度反应为核心发展起来的免疫学检测方法。ELISA方法的优点是灵敏度高、设备简单、可实现高通量定量检测；缺点是试剂盒需冷藏保存、反应过程需控制温度，主要适用于大批量样品的检测和基层实验室应用。GICT法检测灵敏度略低于ELISA法，但具有操作简便、快速、且试剂盒可在常温保存等优点，尤其适合开展快速检测。开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果出现假阳性或假阴性问题，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，如CN105586316A公开了的一种呋喃妥因残留标示物氨基乙内酰脲的单克隆抗体制备方法，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。
技术实现思路
本专利技术提供了一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗1-氨基-乙内酰脲的单克隆抗体。一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:C2015141；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。本专利技术提供了所述杂交瘤细胞株在制备检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒或试纸条中的应用。本专利技术提供了一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：(1)将牛血清白蛋白和1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞。(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；所述1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～60:1；所述偶联物的偶联率为3～20:1。具体地，步骤(1)中，利用对醛基苯甲酸对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD)进行衍生化，衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(AHD-CP)与牛血清蛋白(bovineserumalbumin,BSA)偶联生成AHD-CP-BSA，高分辨率离子肼质谱法对联物进行验证。作为优选，AHD-CP与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30:1；所述偶联物的偶联比平均值为5.48:1。步骤(2)中，所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，用AHD-CP与AHD-CP–OVA(AHD-CP与卵清蛋白偶联物)进行竞争法筛选、经克隆后，获得所述杂交瘤细胞株。作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。所述骨髓瘤细胞为复壮的SP2/0细胞。所述杂交瘤细胞株的抗体基因型：重链(IgG)V基因为MusmusIGHV6-6*02F，J基因为MusmusIGHJ1*03F，D基因为MusmusIGHD2-5*01F；轻链(kappa)V基因为MusmusIGKV9-124*01F。本专利技术还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1k链，与呋喃妥因代谢物有特异性反应。作为优选，所述单克隆抗体通过杂交瘤细胞株或其传代细胞株体外培养的方式获得。具体地，本专利技术采用杂交瘤细胞株或其传代细胞在1640培养基中培养，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，再利用硫酸铵沉淀法和透析法获得初步纯化的抗体。本专利技术还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留1-氨基-乙内酰脲中的应用。本专利技术还提供了一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒，含有所述的单克隆抗体。具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、酶标板、1-氨基-乙内酰脲标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有呋喃妥因代谢物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的1-氨基-乙内酰脲量成反比。根据1-氨基-乙内酰脲标准品做出的标准曲线，计算出样品中的呋喃妥因代谢物的含量。本专利技术还提供了一种用于检测1-氨基-乙内酰脲的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金或酶标记的所述的单克隆抗体。本专利技术的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有AHD-CP-牛血清蛋白偶联物(AHD-CP-BSA)，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗选用羊抗鼠IgG。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果为：本专利技术以AHD-CP与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后得到的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株在体外培养时可大量分泌抗AHD衍生化产物的特异性抗体，可用于呋喃妥因代谢物的快速、准确免疫检测和免疫分析。附图说明图1为免疫抗原(AHD-CP-BSA)的质谱图；图2为生物膜干涉法验证阳性克隆抗原-抗体间亲和力；图3为生物膜干涉法测试不同浓度AHD-CP对抗原-抗体反应的抑制效果；图4为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11的染色体标本；图5为单抗对AHD-CP竞争ELISA的标准曲线；图6为重组纯化蛋白(ProteinG)纯化抗体电泳图；图7为免疫胶体金试剂条检测添标样本及同类药物交叉反应试验结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1杂交瘤细胞株2G9A3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株2G9A3‑35H11，保藏编号为CCTCC NO:C2015141。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗1-氨基-乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株2G9A3-35H11，保藏编号为CCTCCNO:C2015141。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测1-氨基-乙内酰脲的试剂盒或试纸条中的应用。3.一种制备如权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，包括：(1)将牛血清白蛋白和1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得脾细胞；(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；其特征在于，所述1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟与牛血清白蛋白的投料摩尔比为30～60:1；所述偶联物的偶联率为3～20:1。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳爱春，刘超，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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