本发明专利技术公开了抗C肽单克隆抗体及其在检测C肽含量中的用途。本发明专利技术分别采用C肽-GST和?C肽-Trx为免疫原，通过细胞融合技术筛选获得两株杂交瘤细胞株，其微生物保藏编号分别为CGMCC?NO.6804和CGMCC?NO.6805，它们所分泌的两种单克隆抗体能够相互配对，通过双抗夹心ELISA法检测血清中C肽含量，检测结果具有较高的准确性和灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体，尤其涉及配对的抗C肽单克隆抗体以及分泌该抗C肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本专利技术进一步涉及它们在制备检测或诊断C肽的试剂或药物中的用途，属于C肽的检测或诊断领域。
技术介绍
C肽(C-P印tide)又称连接肽，是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体——胰岛素原。一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C肽。测定C肽能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有很大的意义，C肽没有胰岛素的功能，而胰岛β细胞分泌的胰岛素和C肽呈等分子关系，这也就是说，分泌几个胰岛素分子，同时必然分泌几个C肽分子。血中C肽浓度可间接反应胰岛素浓度。C肽不受肝脏酶灭活，半衰期比胰岛素长，经肾脏直接在尿中排泄，故血中C肽的浓度可更好地反映胰岛的功能。C肽的清除主要通过肾脏降解和排泄，C肽在尿中的浓度高于血浆中的浓度。治疗用的胰岛素不含C肽，因此，C肽不受外源性胰岛素的影响，这是在研究胰岛β细胞功能方面比胰岛素优越之处。C肽释放试验在某种意义上可代替胰岛素释放试验，可用于正接受胰岛素治疗的患者，C肽 浓度的测定是诊断和理解糖尿病临床状况的有用指标。C肽由31个氨基酸残基构成，分子较小，通过多肽合成的方式得到的C肽稳定性很差，容易降解，无论做为免疫抗原或筛选抗原均不合适。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供相互配对的两种抗C肽单克隆抗体；本专利技术的目的之二是提供分泌所述抗C肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之三是将所述的抗C肽单克隆抗体应用于诊断或检测C肽；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术采用C肽-GST做免疫原，C肽-Trx做为筛选抗原，筛选获得2株杂交瘤细胞株，3G1和5F7 ;采用C肽-Trx做免疫原，C肽-GST做为筛选抗原，筛选获得3株杂交瘤细胞株，2A9，5C8 和 5B12。本专利技术通过进一步的试验发现采用C肽-GST做免疫原筛选得到的杂交瘤细胞株5F7所分泌的单克隆抗体和采用C肽-Trx做免疫原筛选得到的杂交瘤细胞株5B12所分泌的单克隆抗体，二者之间能够相互配对，作为一对配对的单抗克隆抗体，通过双抗夹心ELISA法应用于检测C肽，检测结果具有较高的准确性和灵敏度。本专利技术将杂交瘤细胞株5F7提交专利认可的机构进行保藏；其微生物保藏编号为=CGMCC N0.6804 ;保藏时间为:2012年11月9日；其分类命名为:C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位:中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术将杂交瘤细胞株5B12提交专利认可的机构进行保藏；其微生物保藏编号为:CGMCC N0.6805 ;保藏时间为:2012年11月9日；其分类命名为:C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位:中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术采用大肠杆菌表达的带有两种不同标签的C肽融合蛋白，解决C肽分子量小、不稳定的问题。采用两种融合蛋白分别做为抗原，免疫小鼠，采用两种抗原交叉进行筛选，既避免了得到抗标签的单抗，又增加了得到抗不同表位单抗的机会，从而增加了可用于夹心法检测C肽的配对单抗的机会。对于一种稳定性差的多肽C肽，采用两种不同标签，表达两种带有目的蛋白的融合蛋白，经已有的免疫学反应检测，可以与已有的特异性抗体反应；采用其中一种融合蛋白做为免疫原，用另外一种融合蛋白做为筛选用抗原，获得单克隆抗体，并进行配对实验。由于表达融合蛋白的分子伴侣不同，蛋白的构象可能有所差异，从而可能得到针对不同表位的单抗，使配对成功的机会增加。本专利技术通过表达两种不同标签的融合蛋白分别用于免疫和检测，使得到配对单抗的几率增加，进而得到了抗不同表位的能力，从而增强了检测C肽的敏感性和准确性。本专利技术与现有技术相比，本专利技术将得到的两种带有标签的融合蛋白作为免疫原，由于不同标签融合蛋白的蛋白构象不同，其增加了抗不同表位抗体产生的机会；以带有与免疫原不同标签的融合蛋白作为筛选抗原，避免了 C肽不稳定造成的筛选结果不稳定。同时，使用GST和Trx作为标签，可增加蛋白的可溶性及稳定性，且便于纯化。附图说明图1为制备配对抗体的流程图。图2为以5F7/5B12作为配对抗体进行双抗夹心ELISA检测C肽的结果。具体实施方式 下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1制备C肽-GST及C肽-Trx融合蛋白I)实验材料表达载体:pGEX_4T_l 购于 GE healthcare, pET32 购于 invitrogen ;表达宿主菌:大肠杆菌BL21(DE3)，购于北京天根生物技术有限公司；酵母粉和蛋白胨:均为Oxide公司产品；2)实验方法将C肽基因序列(核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示；所编码的氨基酸序列为SEQ IDN0.2所示)5’端带有BamHI位点，3’端带有XhoI位点，插入在pMD_18_T载体上，将目的基因用BamHI与XhoI双酶切后分别插入到用相同方法处理的pGEX_4T_l与pET32a载体上，构建成GST-C肽表达载体pGEX-C peptide与Trx-C肽表达载体pET32a_C peptide,将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过用菌落PCR的方法挑选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子在LB培养基中培养，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。诱导表达后的菌液进行细胞破碎。对于细胞破碎，可以采用常规的细胞破碎方法，例如在8000-12000转/分的条件下、离心5-10分钟，离心后的上清用0.22 μ m滤膜过滤，经过滤膜过滤后，用GST柱或镍柱进行亲和纯化，优选GE公司的GSTrap FF或HisTrap FF预装柱进行纯化，按纯化柱填料产品说明书提供的方法进行纯化，得到C肽-GST及C肽-Trx融合蛋白。实施例2制备抗C肽配对单克隆抗体I)实验材料SP 2/0购自上海生化所细胞中心；Balb/c小鼠购自中国医学科学院实验动物中心；胎牛血清:杭州四季青公司产品；DMEM、HAT和HT均为Invitrogen公司产品；50%PEG1450溶液为Sigma公司产品；其它药品均为分析纯等级。2)实验方法2.1小鼠免疫选取6-8只6-8周龄雌性Balb/c小鼠用大肠杆菌表达的C肽-GST和C肽-Trx融合蛋白分别进行免疫。在细胞融合前进行3次免疫。首免:取50 μ g/小鼠的抗原与等体积弗氏完全佐剂乳化后注射到小鼠颈背部皮下，每只小鼠注射0.2ml ;二免:首免3周后取50μ g/小鼠的抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化后注射到小鼠颈背部皮下，每只小鼠注射0.2ml ;三免:二免3周后，取50μ g/小鼠的抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化后注射到小鼠颈背部皮下，每只小鼠注射0.2ml。三免后一周，小鼠断尾采血，采用间接ELISA方法测定抗血清效价。2.2血清抗体效价检测采用间本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC?NO.6804。
【技术特征摘要】
1.一株C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为:CGMCCN0.6804。2.—株C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏编号为:CGMCCN0.6805。3.权利要求1所述的C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。4.权利要求2所述的C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体。5.权利要求1或2所述的C肽单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备诊断或检测C肽含量试剂或药物中的用途。6.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京利德曼生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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