本发明专利技术公开了一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，包括人胰腺癌细胞系PANC-l培养、流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞、无血清悬浮培养PANC-l干细胞球细胞、过表达miR-200a。本发明专利技术操作方便，效果好，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法。
技术介绍
现有的科学研究中，经常需要进行抑制胰腺癌干细胞干性特征，但现有的方法在操作方便性、成本、效果等方面存在不理想之处。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作方便，效果好的miR_200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法。本专利技术的技术解决方案是:一种，其特征是:包括下列步骤:A)人胰腺癌细胞系PANC-1培养以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液为培养基，在37°C、5% CO2饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC-1，每2-3天传代一次，每传代一次用0.25%胰蛋白酶消化；B)流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞( I)将PANC-1癌细胞消化成单细胞悬液细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗I遍，加入0.25%胰蛋白酶，37°C消化5min ;待细胞变圆，加入含血清的完全培养基(即含10%胎牛血清的DMEM培养液)，吸管吹打数次；移入无菌离心管，IOOOr / min离心5min，PBS液重悬细胞，血球计数板计数；(2)抗体孵育每IXlO6个细胞分别加入20 μ I PE标记的抗人CD24 (anti_CD24phycoerythrin)> APC 标记的抗人 CD44 (ant1-CD44al1phycocyanin)和 FITC 标记的抗人ESA (ant1-ESA-FITC)，稀释度均为1:40，冰浴30min，PBS清洗2次；对照组不加抗体；应用流式细胞仪进行流式检测及分选(步骤按流式细胞仪说明书操作)，分选得到CD24+CD44+ESA+ 细胞亚群；C)无血清悬浮培养PANC-1干细胞球细胞(1)干细胞球的培养将分选得到的CD24+CD44+ESA+细胞亚群用DMEM-F12培养基(含有B2750 X、N2100X，表皮生长因子(EGF) 1Ong / ml、成纤维生长因子(FGF) 20ng / ml、血小板衍生因子(PDGF)20ng/ml、青霉素100U / ml、链霉素IOOug / ml)重悬，在37°C、5% CO2的培养条件下培养，当培养至第5-7天时，形成球状；(2)干细胞球的传代当干细胞球长至第10天左右，1000r/min离心5min,去上清,用0.25%胰蛋白酶消化3min，加入胰酶抑制剂中和后吹打成单细胞悬液，接种于DMEM-F12无血清培养基中继续培养，为第二代PANC-1干细胞球，体外连续培养并传代；D)过表达 miR_200a(I)合成miR_200a的前体片段和阴性对照；(2)取对数生长期细胞进行细胞转染，按照InvitrogenLipofectamine2000说明书分别转染到胰腺癌干细胞中。本专利技术操作方便，效果好，成本低。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1、图2、图3分别是流式细胞仪检测胰腺癌细胞表面标记物⑶24、⑶44和ESA表达结果图；图4是胰腺癌细胞株PANC-1和流式细胞分选出的⑶24+⑶44+ESA+细胞亚群在培养基中的表型观察图。图5是实时荧 光定量PCR仪检测胰腺癌细胞PANC-1和⑶24+CD44+ESA+细胞亚群中miR-200a的表达量示意图。图6是⑶24+⑶44+ESA+细胞亚群中过表达miR_200a mimic后细胞表型变化图(图中A为未处理组，B为阴性对照组，C为miR-200a过表达组)。图7、图8分别是CD24+CD44+ESA+细胞亚群中过表达miR-200amimic后实时荧光定量PCR仪检测miR-200a和胚胎干性基因0ct_4和Nanog基因的表达量示意图。具体实施例方式一种，包括下列步骤:A)人胰腺癌细胞系PANC-1培养以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液为培养基，在37°C、5% CO2饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC-1，每2-3天传代一次，每传代一次用0.25%胰蛋白酶消化；B)流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞(I)将PANC-1癌细胞消化成单细胞悬液细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗I遍，加入0.25%胰蛋白酶，37°C消化5min ;待细胞变圆，加入含血清的完全培养基(即含10%胎牛血清的DMEM培养液)，吸管吹打数次；移入无菌离心管，IOOOr / min离心5min，PBS液重悬细胞，血球计数板计数；(2)抗体孵育每IXlO6个细胞分别加入20 μ I PE标记的抗人CD24 (anti_CD24phycoerythrin)> APC 标记的抗人 CD44 (ant1-CD44al1phycocyanin)和 FITC 标记的抗人ESA (ant1-ESA-FITC)，稀释度均为1:40，冰浴30min，PBS清洗2次；对照组不加抗体；应用流式细胞仪进行流式检测及分选(步骤按流式细胞仪说明书操作)，分选得到CD24+CD44+ESA+ 细胞亚群；C)无血清悬浮培养PANC-1干细胞球细胞(I)干细胞球的培养将分选得到的CD24+CD44+ESA+细胞亚群用DMEM-F12培养基(含有B2750 X、N2100X，表皮生长因子(EGF) IOng / ml、成纤维生长因子(FGF) 20ng / ml、血小板衍生因子(PDGF)20ng/ml、青霉素IOOU / ml、链霉素IOOug / ml)重悬，在37°C、5% CO2的培养条件下培养，当培养至第5-7天时，形成球状；(2)干细胞球的传代当干细胞球长至第10天左右，1000r/min离心5min,去上清,用0.25%胰蛋白酶消化3min，加入胰酶抑制剂中和后吹打成单细胞悬液，接种于DMEM-F12无血清培养基中继续培养，为第二代PANC-1干细胞球，体外连续培养并传代；D)过表达 miR_200a(I)合成miR_200a的前体片段和阴性对照；(2)取对数生长期细胞进行细胞转染，按照InvitrogenLipofectamine2000说明书分别转染到胰腺癌干细胞中。E)实时荧光定量PCR检测miR_200a和胚胎干性基因0ct_4和Nanog的表达(I)收集未转染的细胞和转染48h后的胰腺癌干细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，将其反转录成cDNA，cDNA合成过程中分别采用miR_200a的RT特异性引物和OligodT随机引物。(2)以cDNA为模板，利用miR_200a、Oct-4和Nanog特异性引物和染料分子Sybergreen进行PCR扩增，分别以U6RNA和GAPDH作为内参。(3)荧光定量 PCR (7500)的反应体系为 20 μ 1，其中 miR_200a、0ct_4、Nanog、U6RNA和GAPDH的上下游引物各 0.5 μ 1，I μ I cDNA模板，10 μ I Sybergreen，双蒸水补足到20 μ I。(4) 95°C预变性10min，95°C变性10s，60°C退火30s，扩增35个循环，操作步骤及加样剂量严格按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行。(5)每组重复实验3次。(6)结果用 7500System Software V2.0 分析。表1:PANC-1 细胞中 CD24、CD44 和 ESA 的表达 CD24+CD44+CD24+CD44+ESA+双本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR?200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，其特征是：包括下列步骤：A）人胰腺癌细胞系PANC?l培养以含10?％胎牛血清的DMEM培养液为培养基，在37?℃、5％?CO2饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC?l，每2?3天传代一次，每传代一次用?0.25?％胰蛋白酶消化；B）流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞（1）将PANC?1癌细胞消化成单细胞悬液细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗1遍，加入0.25?％胰蛋白酶，37℃?消化5?min；待细胞变圆，加入含血清的完全培养基，吸管吹打数次；移入无菌离心管，1000?r／min离心5?min，PBS液重悬细胞，血球计数板计数；（2）抗体孵育每1×106个细胞分别加入20?μl?PE标记的抗人CD24、APC标记的抗人CD44和FITC标记的抗人ESA，稀释度均为1:40，冰浴30?min，PBS清洗2次；对照组不加抗体；应用流式细胞仪进行流式检测及分选，分选得到CD24+CD44+ESA+细胞亚群；C）无血清悬浮培养PANC?l干细胞球细胞(1)?干细胞球的培养?将分选得到的CD24+CD44+ESA+细胞亚群用DMEM?F12培养基重悬，在37℃、5％?CO2的培养条件下培养，当培养至第5?7天时，形成球状；(2)?干细胞球的传代当干细胞球长至第10天左右，1000?r/min离心5?min，去上清，用0.25?％胰蛋白酶消化3?min，加入胰酶抑制剂中和后吹打成单细胞悬液，接种于DMEM?F12无血清培养基中继续培养，为第二代PANC?l干细胞球，体外连续培养并传代；D）过表达miR?200a（1）合成miR?200a的前体片段和阴性对照；（2）取对数生长期细胞进行细胞转染，按照Invitrogen?Lipofectamine?2000?说明书分别转染到胰腺癌干细胞中。...
【技术特征摘要】
1.一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，其特征是:包括下列步骤: A)人胰腺癌细胞系PANC-1培养 以含10 %胎牛血清的DMEM培养液为培养基，在37 °C>5% CO2饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC-1，每2-3天传代一次，每传代一次用0.25 %胰蛋白酶消化； B)流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞 (1)将PANC-1癌细胞消化成单细胞悬液 细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗I遍，加入0.25 %胰蛋白酶，37°C消化·5 min ;待细胞变圆，加入含血清的完全培养基，吸管吹打数次；移入无菌离心管，1000 r /min离心5 min, PBS液重悬细胞,血球计数板计数； (2)抗体孵育 每I X IO6个细胞分别加入20 μ I PE标记的抗人⑶24、APC标记的抗人⑶44和FITC标记的抗人ESA，稀释度均为1:40，冰浴30 min, PB...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆玉华，王志伟，朱铭岩，陆晶晶，李晓红，朱慧，范向军，朱沙俊，王雷，鞠少卿，吴信华，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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