一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用制造技术

一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术单克隆细胞株2E5已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10873。本发明专利技术采用活化酯法将原药头孢噻呋与BSA偶联制备免疫原，头孢噻呋与OVA偶联制备包被原。对小鼠进行免疫后得到一株特异性抗头孢噻呋杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，仅特异性针对头孢噻呋，与其他头孢类抗生素头孢氨苄、头孢喹肟的交叉率分别为3.12%、5.3%，与其它头孢类抗菌素的交叉率均小于0.1%，因此具有很高的特异性。本发明专利技术获得的抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢噻呋的目的。本发明专利技术还提供了一种新的制备针对特定头孢菌素特异性抗体的思路，得到很好的特异性单克隆细胞株。

Monoclonal antibody hybridoma cell line 2E5 with specific anti cephalosporin and application thereof

The utility model relates to a monoclonal antibody hybridoma cell line 2E5, which is a specific monoclonal antibody, and belongs to the field of food safety immunoassay technology. The invention of monoclonal cell line 2E5 has been preserved in general microbiology center, Chinese microbe preservation Management Committee referred to as CGMCC, the preservation number is CGMCC No.10873. The invention adopts the active ester method to prepare the immunogen with the coupling of the technical cephalosporin and the BSA, and the preparation of the raw material is carried out by the coupling of the cephalosporin and the OVA. After immunization of mice, a specific anti tumor cell line was obtained. This cell line secreting monoclonal antibody, only specific to ceftiofur, crossover rate and other cephalosporins cephalexin, cefquinome were 3.12%, 5.3%, crossover rate and other cephalosporin antibiotics were less than 0.1%, so it has very high specificity. The anti ceftiofur monoclonal antibody hybridoma cell line, not only has better detection sensitivity and affinity, and cross reaction with other cephalosporin antibiotics can achieve the detection rate is low, with cefotaxime specific purpose. The invention also provides a new method for the preparation of specific cephalosporin prime specific antibodies, monoclonal cell lines are very good.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
头孢噻呋(EFT)，英文名称为ceftiofur，分子式为C19H17N5O7S3，分子量为523.56，化学名称为(6R,7R)-7-[2-(2-氨基噻唑-4-基)(甲氧基亚胺基)乙酰胺基]-3-[(2-呋喃基羰基)硫甲基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸。CAS登录号为80370-57-6。头孢噻呋为抗微生物药，是头孢菌素类半合成的第三代动物专用头孢菌素。头孢噻呋是第一个动物专用的头孢菌素类抗生素。其母核是由头孢菌素C裂解而获得的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。具广谱杀菌作用，对革兰氏阳性，革兰氏阴性包括产内酰胺酶菌株均有效。抗菌活性比氨苄西林强，对链球菌的活性也比喹诺酮类抗菌药强。由于其优良的抗菌活性和药动力学特点，陆续被美国、加拿大、日本及欧洲一些国家正式批准用于肉牛、奶牛、马、猪、羊的呼吸道疾病的治疗，显示了其在兽医临床应用的广阔前景。一般来说，头孢噻呋对各种动物的毒副作用较为轻微，大多数动物多可耐受，无需停药。少数动物可能出现皮疹、瘙痒等不良症状，偶见极度过敏现象。另一方面，长期食用头孢噻呋残留的动物性食品还可引起细菌耐药性，造成人体微生物环境平衡紊乱和失调。由于头孢噻呋被广泛用于治疗牛乳腺炎和其它乳牛疾病，该药物在乳汁中的残留也会给乳制品的质量带来严重影响。此外，头孢噻呋主要排泄途径为肾脏，所以肾毒性较强。欧盟颁布头孢噻呋最大残留限量在牛奶中最低，限量不得超过100μg/kg。所以有必要建立头孢噻呋的快速检测方法。目前头孢噻呋的检测方法主要是仪器检测方法和免疫分析检测方法，仪器检测方法仪器成本高，操作复杂，需要专职人员操作，而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对头孢噻呋具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立头孢噻呋酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。本专利技术的技术方案，一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10873。抗头孢噻呋单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.10873的特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5分泌产生。所述抗头孢噻呋单克隆抗体的应用，其在食品安全中头孢噻呋残留检测中的应用。本专利技术提供的杂交瘤细胞株2E5细胞株的制备基本步骤为：（1）免疫原的制备与鉴定：头孢噻呋通过活化酯法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过SDS-PAGE凝胶电泳表征；（2）小鼠的免疫：将抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2E5；（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。本专利技术的有益效果：本专利技术获得的抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅有较好的检测灵敏度和亲和力，且对其它头孢类抗菌素的交叉反应率低，可以达到特异性检测头孢噻呋的目的。本专利技术一种新的制备针对特定头孢菌素特异性抗体的思路，得到很好的特异性单克隆抗体细胞株。生物材料样品保藏：一株特异性抗头孢噻呋单克隆细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏编号为CGMCCNo.10873。附图说明图1是免疫原的SDS-PAGE凝胶电泳表征。1、BSA，2、EFT-EDC-BSA(EFT︰BSA摩尔比=120︰1)，3、EFT-EDC-BSA(EFT︰BSA摩尔比=100︰1)，4、EFT-EDC-BSA(EFT︰BSA摩尔比=80︰1)。图2是2E5单克隆抗体对头孢噻呋EFT的标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将EFT完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对EFT有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株2E5的制备（1）完全抗原的合成：取4.5mgEFT，再加入2.0mgEDC和1.0mgNHS，使用DMF溶解，室温搅拌，活化4h；另取5mgBSA溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的头孢噻呋溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，得免疫原，-20℃分装保存。（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取头孢噻呋完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、将脾细胞和SP2/0细胞按照5~10:1的计数比例混本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10873。

【技术特征摘要】
1.一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2E5，已保藏于中国微生物菌种保
藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.10873。
2.抗头孢噻呋单克隆抗体，其特征在于：它由所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玲玲，朱雨婷，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，
申请(专利权)人：无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32