一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术将苯巴比妥完全抗原与福氏试剂混合乳化注射免疫BALB/c小鼠，将高效价和高抑制的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法筛选细胞，并进行多次亚克隆，得到分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株。此细胞株分泌产生的抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体对苯巴比妥类药物具有较好亲和力和较高灵敏度，对苯巴比妥的50％抑制浓度(IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于食品安全免疫检测
，尤其是指一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]巴比妥类药物是一种具有麻醉和镇静作用的中枢神经系统抑制剂，用于治疗脑外伤后患者的癫痫、头痛、焦虑和镇静。根据剂量的不同，巴比妥酸盐可产生广泛的影响。例如，它们在相对较低的剂量下可以引起放松和困倦，但在高剂量时却会抑制呼吸系统。此外，他们有潜在的身体和心理成瘾的风险，并可能导致严重的不良影响。由于其成瘾性，巴比妥酸盐作为镇静/催眠药的使用。如今，此类药物的广泛滥用引起了公众的广泛关注。因此，生物标本中巴比妥酸盐的测定不仅是治疗性药物监测和中毒调查的必要手段，而且在新制剂开发和法医学中也具有重要意义。1911年合成的第2种巴比妥酸类化合物
‑
苯巴比妥，于1912年作为镇静催眠药开始投入使用，检测样本通常为硬胶囊、软胶囊、丸剂、片剂、散剂及口服液等保健食品，或者检测人体血浆，唾液，头发等。
[0003]苯巴比妥的常规检测方法包括高效液相色谱串联质谱，超高效液相色谱，超高效液相色谱
‑
串联质谱和气相色谱串联质谱等人。这些方法在不同程度上存在一些缺陷：耗时，昂贵的仪器和大量的样品预处理程序等。因此，这些方法不适合现场进行高通量分析苯巴比妥的检测。此外，也已报道了用表面增强拉曼光谱测定苯巴比妥的含量。但是纳米技术具有很高的灵敏度和可靠性，高度依赖精确的数据采集，因此需要分析系统，这意味着这些方法在现场分析中的应用受到限制。因此，有必要进一步开发一种满足政府监管和企业自检要求的快速检测方法。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
[0005]本专利技术的第一个目的在于提供一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.45123，保藏日期2022年03月03，分类命名单克隆细胞株。抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体，其是由保藏编号CGMCC No.45123杂交瘤细胞株分泌产生。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供所述分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)制备苯巴比妥完全抗原：以苯巴比妥的结构类似物苯巴比妥
‑1‑
丁酸即半抗原为原料，通过活化酯法蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联
的小分子苯巴比妥半抗原，苯巴比妥完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；
[0008](2)小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将步骤(1)所得苯巴比妥完全抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠。首次免疫使用苯巴比妥完全抗原与福氏完全佐剂乳化得到的免疫原1进行注射，加强免疫使用苯巴比妥完全抗原与福氏不完全佐剂乳化得到的免疫原2进行注射，冲刺免疫时使用腹腔注射。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在第五次免疫后进行冲刺免疫；
[0009](3)细胞融合与杂交瘤细胞株建立：将步骤(2)中冲刺免疫后的小鼠，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；
[0010](4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC
50
值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述苯巴比妥半抗原的分子式：
[0012][0013]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述苯巴比妥完全抗原的分子式：
[0014][0015]在本专利技术的一个实施例中，所述苯巴比妥完全抗原通过以下方法制备得到：将半抗原(苯巴比妥
‑1‑
丁酸)、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于有机溶剂中，搅拌活化，得到活化液；另取牛血清蛋白(BSA)溶解于的碳酸盐缓冲溶液(CB)溶液中；将上述活化液加入BSA溶液中，搅拌反应，得到所述苯巴比妥完全抗原。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，所述有机溶剂为N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述首次免疫的剂量为100μL/只；所述冲刺免疫的剂量为前一次免疫剂量的一半，为25μL/只，与生理盐水混匀注射。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，共包括6次免疫，前5次免疫的间隔时间为3周，冲刺免疫与加强免疫的间隔为18天。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞融合是在冲刺免疫3天后进行。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 2000)
法进行的。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，亚克隆的次数为3次。
[0022]本专利技术的第三个目的在于提供所述杂交瘤细胞株在制备抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体中的应用。
[0023]本专利技术的第四个目的在于提供一种抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体，所述抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体是由保藏编号为CGMCC No.45123的杂交瘤细胞株分泌所得。
[0024]在本专利技术的一个实施例中，所述苯巴比妥类药物为苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥钠中的一种或多种。
[0025]本专利技术提供了上述一种分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体方面的应用。
[0026]本专利技术提供了上述一种抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45123的杂交瘤细胞，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆多残抗体低温保存。
[0027]在本专利技术的一个实施例中，所述方法为，取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1
×
106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸
‑
饱和硫酸铵法纯化，获得的抗体置于
‑
20℃保存。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.45123，保藏日期为2022年03月03日，分类命名为单克隆细胞株。2.权利要求1所述的分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用苯巴比妥半抗原制备苯巴比妥完全抗原，将获得的苯巴比妥完全抗原与完全福氏佐剂进行乳化得到免疫原1，苯巴比妥完全抗原与不完全福氏佐剂进行乳化得到免疫原2；(2)将步骤(1)所得免疫原1对小鼠进行首次免疫，并用免疫原2进行加强免疫，用苯巴比妥完全抗原与生理盐水混合进行冲刺免疫；(3)将步骤(2)中冲刺免疫后的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到所述杂交瘤细胞株。3.根据权利要求2所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，严婕妤，胥传来，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，马伟，郝昌龙，宋珊珊，郭玲玲，胥欣欣，倪萍，
申请(专利权)人：无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：