一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株10

【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区(以下简称tH)单克隆抗体的杂交瘤细胞株10
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1hcy及应用；本专利技术利用原核表达并纯化的重组 tH蛋白为检测抗原，以杂交瘤细胞株10
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1hcy分泌的抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体为竞争抗体，建立cELISA方法，并优化形成了cELISA试剂盒。

技术介绍

[0002]小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petitsruminants virus，PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性A类传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，主要表现为发热、腹泻、肠炎、肺炎等临床症状，发病率和致死率均非常高，为一种重大跨国传播的动物疫病。因此，我们必须加强对PPR的研究工作，特别是诊断制剂。
[0003]H蛋白是PPRV的一种重要的跨膜糖蛋白，含有609个氨基酸，估计分子质量为70kD；构成病毒粒子表面的纤突，具有神经氨酸酶和血凝素的功能，且含有T细胞决定簇，是几种结构蛋白中最易变异的蛋白。H蛋白的主要作用是与宿主细胞膜受体发生结合，调节病毒吸附并侵入宿主细胞，并刺激机体产生中和抗体，参与体液保护性免疫，是病毒的主要抗原成份，也是引起宿主细胞病变(CPE)的决定因素。近年来，国内外学者利用多种表达体系对PPRVH蛋白的表达进行了研究。Stech等在哺乳动物细胞中表达的重组H糖蛋白具有生物活性。 Balamurugan利用Vero细胞系表达H糖蛋白，并评估了其作为酶联免疫吸附反应诊断抗原的潜力。Diallo等把PPRV的F基因和H基因引进山羊痘病毒疫苗株的基因组中，产生的重组病毒可以有效的防止PPRV和山羊痘病毒的感染。此外，还有研究发现去除胞内区的截短H 蛋白(truncated H protein)仍具有正常的与细胞受体结合的能力。
[0004]除了传统的临床诊断方法，目前已经研究出多种针对PPRV抗体的诊断技术，这些方法包括病毒中和试验(VN)、琼脂扩散(AGID)、免疫荧光抗体试验(IFAT)和对流免疫电泳 (CIEP)等。随着免疫学和分子生物学的在动物疫病诊断中的应用和发展，目前已有PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)和其它分子生物学检测方法等多种PPR检测方法，其中间接竞争ELISA(cELISA)和PCR方法是OIE推荐的检测方法。由于感染PPRV的动物血清抗体有相当一部分是针对N蛋白和H蛋白的，因此已经研制出许多针对PPRV和RPV N、H蛋白的竞争ELISA试验方法，并且该方法已成为OIE的标准检测方法之一。Libeau应用重组杆状病毒表达的N蛋白建立了检测PPRV抗体的cELISA方法，单抗和待检血清抗体竞争性地结合抗原，提高了试验的特异性。Saliki等建立了针对PPRV H蛋白的阻断ELISA(B
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ELISA) 方法，与竞争ELISA原理基本一致，都是两种抗体竞争结合同一抗原表位。但是在cELISA 方法中，样品和单抗同时与抗原结合，而B
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ELISA是先将样品和抗原反应，然后再加入检测单抗，所用的时间要比cELISA方法长。2004年，Singh等制备了一株针对PPRV H蛋白中和表位的单克隆抗体，建立了竞争ELISA的检测方法。与VNT相比，更加方便快捷；但也存在一些缺点，如不能区分RPV
与PRRV。其后韩国科学家Choi等又研发出了一种检测PPR 的快速竞争ELISA(rapid cELISA)，该方法是在包被了PPRV重组核衣壳蛋白(rPPRV
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N) 的反应孔中，将血清与单抗混合孵育30min，然后对单抗进行定量。对249个PPRV阳性血清和733个阴性血清样品进行检测，用该方法检测免疫了RPV的高免血清，VNT≥1:512时，检测结果呈阳性，但显示的抗体滴度只有1:2～1:16；VNT≤1:128，则检测结果呈阴性，说明该方法能较好的区分PPRV与RPV感染。通过对琼脂糖凝胶免疫电泳方法(AGID)和cELISA 两种血清学方法进行比对，发现cELISA的特异性和敏感性高于AGID的，AGID法可将 cELISA阳性样品检测为阴性。
[0005]综上所述，研发出具有快速、特异、敏感的中和抗体诊断试剂盒，具有及其重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒tH单克隆抗体的杂交瘤细胞株；并构建一种具备良好稳定性、特异性、准确性和高亲和力的小反刍兽疫病毒中和抗体cELISA试剂盒及其使用方法。具体包括以下内容：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株10
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1hcy，所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.17289；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；联系电话为010
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64807355。
[0008]第二方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy在生产抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体中的应用。
[0009]第三方面，本专利技术提供了一种抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体，所述抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体由上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy或其传代细胞株分泌产生。
[0010]第四方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy，和/或上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒tH蛋白单克隆抗体在制备用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的检测试剂、试剂盒或试纸条中的应用。
[0011]优选地，所述试剂盒为间接竞争ELISA试剂盒。
[0012]第五方面，本专利技术提供了一种用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的间接竞争ELISA试剂盒，所述试剂盒包括单克隆抗体、包被抗原、包被液、酶标板、标准血清、血清稀释液、酶标二抗、封闭液、显色液、终止液和洗涤液；所述单克隆抗体为上述第三方面所述的抗小反刍兽疫病毒tH单克隆抗体。
[0013]优选地，所述包被抗原为重组小反刍兽疫病毒tH蛋白。
[0014]优选地，所述包被液为0.05mol/L碳酸钠
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碳酸氢钠缓冲液，pH9.6。
[0015]优选地，所述洗涤液为1
×
PBST。
[0016]优选地，所述封闭液为1％BSA。
[0017]优选地，所述终止液为1mol/L H2SO4溶液。
[0018]优选地，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG。
[0019]第六方面，本专利技术提供了一种非本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株能够稳定分泌抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株10
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1hcy，所述杂交瘤细胞株10
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1hcy于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.17289。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy在生产抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体中的应用。3.一种抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体，其特征在于，所述抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy或其传代细胞株分泌产生。4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株10
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1hcy，和/或权利要求3所述的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体在制备用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的检测试剂、试剂盒或试纸中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为间接竞争ELISA试剂盒。6.一种用于检测小反刍兽疫病毒中和抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括单克隆抗体、包被抗原、包被液、酶标板、标准血清、血清稀释液、酶标二抗、封闭液、显色液、终止液和洗涤液；所述单克隆抗体为权利要求3所述的抗小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区单克隆抗体。7.如权利要求8所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原为重组小反刍兽疫病毒H蛋白胞外区。8.如权利要求8所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.05mol/L碳酸钠
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碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；所述洗涤液为1
×
PBST；所述封闭液为1％BSA；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒙学莲，朱学亮，胡林杰，彭泓蛟，祁斌亮，孙跃峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：