生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系建立及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系建立及其应用；利用CRISPR/Cas9技术编码CHO细胞的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的稳定FUT8基因缺失的CHO细胞株(简称FUT8

【技术实现步骤摘要】
生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系建立及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系建立及其应用。
技术介绍
抗体最初用于疾病治疗可追溯至一个世纪之前，不过其飞速发展主要是在近30年的时间。1975年KoehlerandMilstein创立了体外杂交瘤技术，得到了鼠源性的单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代(王志明，高健和李耿，治疗性单克隆抗体药物的现状及发展趋势.中国生物工程杂志，2013(06)：p.117-124)。单克隆抗体具有特异性高，效价高，纯度高，重复性强，成本低并可大量生产等优点，但鼠源性单抗应用于人类具有较强的免疫原性，因此限制了其临床应用。随着现代生物技术的飞速发展，及对抗体分子结构和基因结构的深入了解，抗体药物的发展进入了基因工程抗体阶段。经过鼠源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体及人源性抗体的发展，单克隆抗体作为治疗性药物真正成为可能。近年来，各种基因工程抗体的成功制备和应用，以及抗体生产水平的显著提高使抗体药物的研发进入了一个快速发展的新阶段。目前市场上已有30多种治疗性抗体，主要用于肿瘤、自身免疫病、慢性炎症反应、病毒感染及器官移植排斥的治疗(Elvin，J.G.，R.G.Couston，andC.F.vanderWalle，Therapeuticantibodies：Marketconsiderations，diseasetargetsandbioprocessing.InternationalJournalofPharmaceutics，2013.440(1)：p.83-98.)。在2015年全球药品销售TOP10排行榜中，生物药占有6种，其全球销售总额已超过450亿美元。治疗性抗体已成为目前制药行业增长最快，盈利最大的产品之一。目前在工业上提高抗体的产量主要通过两个方面：一是通过改进工艺参数提高抗体的表达量；二是对抗体结构优化，提高抗体效价。治疗性抗体多数为糖蛋白，最近研究表明粘连在蛋白质上的不同糖链不仅参与器官的形成、老化、感染、癌化、癌转移等多种生命现象，而且可以对抗体的效能产生很大影响(Jefferis，R.，Recombinantantibodytherapeutics：theimpactofglycosylationonmechanismsofaction.TrendsinPharmacologicalSciences，2009.30(7)：p.356-362.)。治疗性抗体发挥作用的方式有几种，最主要的是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)(Iannello，A.andA.Ahmad，Roleofantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicityintheefficacyoftherapeuticanti-cancermonoclonalantibodies.CancerandMetastasisReviews，2005.24(4)：p.487-499.)。ADCC作用是表达抗体Fc受体(FcγRIIIa)的自然杀伤细胞(NK细胞)通过与已结合在靶细胞(病毒感染细胞、癌细胞)表面的IgG抗体的Fc片段结合，从而达到杀伤靶细胞的作用。已有研究表明在IgG抗体的Fc片段CH2结构域Asn297部位的糖链结构去除岩藻糖时，可以增强NK细胞的FcγRIIIa与IgG抗体的Fc片段之间的结合力，从而增强抗体的ADCC效应(Shinkawa，T.，etal.，TheabsenceoffucosebutnotthepresenceofgalactoseorbisectingN-acetylglucosamineofhumanIgG1complex-typeoligosaccharidesshowsthecriticalroleofenhancingantibody-dependentcellularcytotoxicity.JBiolChem，2003.278(5)：p.3466-73.)。α-1，6岩藻糖转移酶(FUT8)是催化岩藻糖残基由二磷酸鸟苷-岩藻糖(GDP-Fuc)转移至N-糖链核心最内侧乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的末位，形成核心岩藻糖的糖基转移酶。可以通过对抗体表达细胞株进行基因工程改造，使细胞株内的FUT8基因沉默，从而产生完全去岩藻糖化的抗体(Malphettes，L.，etal.，HighlyefficientdeletionofFUT8inCHOcelllinesusingzinc-fingernucleasesyieldscellsthatproducecompletelynonfucosylatedantibodies.BiotechnolBioeng，2010.106(5)：p.774-83.)。CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等后可用于定点修饰基因的新的基因编辑技术。是指crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的靶序列剪切双链DNA。与ZFNs/TALENs相比，CRISPR/Cas9更易于操作，只需要设计跟靶序列配对的sgRNA即可，设计原则是在靶序列后紧跟一个PAM位点。效率更高，并且可以在不同的位点同时引入多个突变(Gupta，R.M.andK.Musunuru，Expandingthegeneticeditingtoolkit：ZFNs，TALENs，andCRISPR-Cas9.JClinInvest，2014.124(10)：p.4154-61.)。CHO-S细胞是在工业上真核表达系统中运用最多的来表达抗体的宿主细胞。在本专利技术中，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术来对CHO-S细胞中的FUT8基因进行编辑，以此来使细胞中的α-1，6岩藻糖转移酶的功能丧失，产生完全去岩藻糖化的抗体。在减少或消除抗体岩藻糖表达方面，已经一些研究。(美国专利公开第20040093621号)通过抑制作为岩藻糖合成底物GDP-岩藻糖的合成相关酶(GMD)表达，从而减少抗体糖链中的岩藻糖含量，提高抗体的ADCC效应。(美国专利注册第6602684号)还有使N-乙酰氨基葡萄糖转移酶过度表达，从而影响抗体的糖链合成，抑制岩藻糖结合到抗体的糖型中心，减少岩藻糖的含量。或者通过对抗体Fc片段的部分氨基酸残基选择性突变，使之与NK细胞的FcγRIIIa受体结合能力增强，提高抗体的ADCC作用(Moore，G.L.，etal.，EngineeredFcvariantantibodieswithenhancedabilitytorecruitcomplementandmediateeffectorfunctions.Mabs，2010.2(2)：p.181-189.Michaeli，Y.andY.Reiter，OptimisedFcvariantswithenhancedeffectorfunction.ExpertOpiniononTherapeuticPa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述方法包括：S1、利用CRISPR/Cas9技术，针对CHO‑S细胞FUT8基因的exon9区域设计两对sgRNA；构建FUT8敲除载体pX330‑sgRNA1质粒和pX330‑sgRNA2质粒；S2、将pX330‑sgRNA1质粒和pX330‑sgRNA2质粒利用脂质体转染法共转染进CHO‑S细胞，敲除CHO‑S细胞中的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的稳定FUT8

【技术特征摘要】
1.一种生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述方法包括：S1、利用CRISPR/Cas9技术，针对CHO-S细胞FUT8基因的exon9区域设计两对sgRNA；构建FUT8敲除载体pX330-sgRNA1质粒和pX330-sgRNA2质粒；S2、将pX330-sgRNA1质粒和pX330-sgRNA2质粒利用脂质体转染法共转染进CHO-S细胞，敲除CHO-S细胞中的FUT8基因，得到FUT8基因沉默的稳定FUT8-/-细胞株。2.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述FUT8-/-细胞株的两条等位基因都发生了基因突变。3.根据权利要求2所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述两条等位基因中一条为基因移码，一条为基因缺失。4.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述FUT8-/-细胞株具有兵豆凝集素抗性。5.根据权利要求1所述的生产无岩藻糖单克隆抗体的CHO细胞系的建立方法，其特征在于，所述两对sgRNA中，sgRNA1的碱基序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建伟，宗会芳，张宝红，江华，谢跃庆，韩雷，丁凯，孙涛，
申请(专利权)人：上海交通大学，美国杰科实验室有限公司，杰科天津生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31