一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及一种人源程序性死亡受体hPD‑1单克隆抗体的制备方法，属于抗体的制备方法技术领域。包括以下步骤：hPD‑1胞外段重组基因的构建；hPD‑1胞外段蛋白的制备；将制备好的抗原注射到Balb/c小鼠体内；再加强免疫3次后采血，ELISA检测血清效价；取效价达到要求的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；杂交瘤细胞的克隆化培养；将克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，即可获得抗体浓度很高的腹水单抗；利用Protein A填料纯化单克隆单体。本发明专利技术的方法制备的hPD‑1的单克隆抗体在免疫组化的结果上具有较强的膜定位和具有高特异性、敏感度高、纯度高的优点。

A source program of hPD death receptor 1 monoclonal antibody

The invention relates to a method for preparing human source program death receptor hPD 1 monoclonal antibody, antibody preparation method belongs to the technical field. Includes the following steps: constructing hPD 1 recombinant gene; hPD 1 extracellular protein preparation; prepared antigen injected into Balb/c mice; to strengthen the immune after 3 times of blood serum ELISA titer; spleen cells were fused with myeloma cells immunized to meet the requirements of the Balb/c mice; clonal culture of hybridoma cells; the cloning culture and screened hybridoma cells were inoculated in abdominal cavity of Balb/c mice, can obtain a high antibody concentration of monoclonal antibodies; monoclonal purified monomer using Protein A filler. Has the advantages of strong positioning film prepared by the method of the invention hPD 1 monoclonal antibody in the immunohistochemical results and has high specificity, high sensitivity, high purity.

【技术实现步骤摘要】
一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体
本专利技术属于抗体的制备方法
，具体涉及一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
众所周知，初始T细胞活化离不开抗原肽-MHC分子复合物与T细胞表面受体（TCR）的相互作用，但同时需要抗原呈递细胞表面（APC）的共刺激分子与其表面的相应受体结合来提供第二刺激信号。B7家族作为唯一能从APC单向传送信号至T细胞的共刺激分子，可以调控免疫信号的强度、持续时间和过程。人源程序性死亡分子1（hPD-1）是B7家族的一员，是重要的免疫抑制分子，与其配体PD-Ls结合后，可激活细胞内的抑制信号，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖以及IL-2和IFN-γ等细胞因子的分泌，从而抑制免疫应答反应，参与调节免疫耐受，导致微生物感染和肿瘤细胞的免疫逃逸。hPD-1可表达在激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞等免疫细胞上，属于免疫球蛋白家族。因此，hPD-1作为肿瘤发生、发展、转移以及肿瘤预后的重要指标，需要准确和高灵敏的免疫组化技术对其检测。免疫组化技术是20世纪70年代初SterbBerger在酶标法的基础上以免疫学的抗原抗体反应为理论基础发展起来的技术，可对组织和细胞内的特定抗原或抗体(多肽和蛋白质)进行定位、定性或定量检测。目前，免疫组化技术在临床检测的应用包括良性和恶性肿瘤的诊断与鉴定、肿瘤分期、肿瘤来源的鉴定、区分组织器官交界处肿瘤、发现微小转移灶和指导肿瘤的治疗。因此，有必要制备高纯度、高特异性的hPD-1单克隆抗体，利用免疫组化技术指导肿瘤的诊断和治疗。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。为此采用如下的技术方案：一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示，轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.3-4所示。所述抗体为如下1）或2）所示的蛋白质：1）重链与轻链可变区由SEQIDNO.1-4所示的碱基序列或氨基酸序列组成的蛋白质；2）将SEQIDNO.1-4所示的轻链和/或重链可变区的碱基序列或氨基酸序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质的轻链和/或重链可变区。所述抗体的轻链和/或重链可变区编码DNA分子，所述编码DNA分子为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：1）其轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列所示；2）与SEQIDNO.1-4中序列限定的DNA分子杂交且编码权利要求1-2中任一所述抗体的DNA分子；3）与1）的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1-2中任一所述的抗体的DNA分子。所述的单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。任一所述的抗体在如下a）-c）中任一种中的应用：a）制备特异性结合人源程序性死亡受体PD-1的产品；b)制备利用免疫组化技术检测肿瘤组织中PD-1的产品；c)制备作为治疗肿瘤的药物。一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体的制备方法，采用如下步骤：1）利用分子克隆的方法构建hPD-1胞外段的重组质粒，转化至宿主菌BL21（DE3）中进行蛋白表达，纯化后，获得高纯度、构象均一的hPD-1蛋白；2）将制备好的hPD-1抗原注射至Balb/c小鼠体内；3）重复步骤2）再将强免疫2次后，采血，利用ELISA技术检测血清中抗体效价；4）取效价达到要求（高于100,000）的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；5）对分泌hPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化培养；6）将步骤5）获得的克隆化培养的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，获得hPD-1蛋白单克隆抗体浓度很高的腹水单抗；7）利用ProteinA亲和层析柱对腹水单抗进行纯化；8）特异性检测：利用免疫组化技术对获得的抗体的特异性进行检测；9）利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。具体为：1）获取抗原hPD-1蛋白：人源程序性死亡受体hPD-1是由PDCD-1基因编码的共刺激分子，选取hPD-1蛋白的胞外结构域作为抗原，其碱基数约400bp，蛋白分子量18kDa左右。利用软件Primerpremier5.0设计hPD-1蛋白的胞外结构域的上游引物和下游引物，利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增获得hPD-1蛋白的胞外结构域的基因，分别对该目的基因与表达载体pET-22b进行双酶切，然后利用T4-DNA连接酶进行酶连，获得重组质粒pET-22b-hPD-1。将重组质粒pET-22b-hPD-1转化至宿主菌BL21（DE3）中，进行蛋白表达。根据聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）的结果，hPD-1蛋白的胞外结构域以包涵体的形式表达。将hPD-1蛋白的包涵体溶于含有8M尿素的PBS缓冲液中，进行Ni柱纯化，然后利用复性缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，400mML-Arghydrochloride，2mMEDTA，5mMCystamine，0.5mMCysteamine），进行hPD-1蛋白的复性，获得空间折叠正确、构象均一的抗原。最后再利用AKTA蛋白纯化系统进一步纯化hPD-1蛋白，获得高纯度，高构象均一性的抗原蛋白。2）用生理盐水将步骤1）获得的hPD-1蛋白稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂（IFC）混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化后，对Balb/c小鼠进行免疫，每只小鼠注射剂量为：100μg。3）重复步骤2）所述，加强免疫两次：第15天，每只小鼠注射剂量为：50μg；第29天，每只小鼠注射剂量为：50μg。4）利用ELISA检测Balb/c小鼠血清中的抗体效价，取效价达到要求（高于100,000）的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。5）融合2周左右，利用ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，获得分泌hPD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。6）对于5）步骤获得的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化培养，直至100%孔分泌hPD-1蛋白单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。7）将步骤6）克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，获得hPD-1蛋白单克隆抗体浓度很高的腹水单抗。8）将2g左右的ProteinA填料与10mLpH7.0的Tris缓冲液混合，倒入层析柱，静置5-10min，使得填料自然沉降，得到无气泡的ProteinA填料柱；加入10倍柱体积的pH7.0的Tris缓冲液，并以合适的流速冲洗柱子；将步骤7）获得高浓度单抗与pH7.0的Tris缓冲液按照体积比1:2混合后，用0.45μm滤膜过滤后，加入层析柱中进行亲和层析，然后利用洗脱液（pH4.50.1M柠檬酸溶液加pH8.0的中和液）洗脱抗体，将洗脱液利用PBS透析三次，最后利用超滤浓缩管浓缩抗体溶液，获得高纯度、高浓度的hPD-1单克隆抗体。9）利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。本专利技术的优点在于：本抗体是完全人源性抗体，具有高特异性、高亲和力和高灵敏度，且抗体具有很好的膜定位；本专利技术纯化抗体的方法是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源程序性死亡受体hPD‑1单克隆抗体，其特征在于：所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示，轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑4所示。

【技术特征摘要】
1.一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体，其特征在于：所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示，轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.3-4所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体为如下1）或2）所示的蛋白质：1）重链与轻链可变区由SEQIDNO.1-4所示的碱基序列或氨基酸序列组成的蛋白质；2）将SEQIDNO.1-4所示的轻链和/或重链可变区的碱基序列或氨基酸序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质的轻链和/或重链可变区。3.权利要求1-2中任一所述抗体的轻链和/或重链可变区编码DNA分子。4.根据权利要求3所述的编码DNA分子，其特征在于：所述编码DNA分子为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：1)其轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列所示；2)与SEQIDNO.1-4中序列限定的DNA分子杂交且编码权利要求1-2中任一所述抗体的DNA分子；3)与1）的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1-2中任一所述的抗体的DNA分子。5.含有权利要求1-2中任一所述的单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。6.权利要求1-2中任一所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨娟娟，孟春，吕唯，刘照，吴茂，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35