甲胎蛋白检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种甲胎蛋白抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生。本发明专利技术提供了一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括：包被液、由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。本发明专利技术获得了保藏编号为CGMCC No.13808的AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，其产生的抗体可以用于检测AFP抗原，具有较高的灵敏度和准确度，用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。

【技术实现步骤摘要】
甲胎蛋白检测试剂盒
本专利技术属于试剂盒
，尤其涉及一种甲胎蛋白检测试剂盒。
技术介绍
目前，恶性肿瘤已经排在我国居民主要疾病死亡率的首位，成为影响人们健康的头号杀手。根据我国卫生部统计数据，我国每年新发癌症病例约337万，死亡约211万，河北省肿瘤登记地区恶性肿瘤发病率为224.59/10万。肝癌(特别是原发性肝细胞癌，Hepatocellularcarcinoma,HCC)已经成为仅次于胃癌的第二大癌症。作为一种高死亡率的疾病，肝癌的病因、发生发展、复发、转移以及诊断和治疗都越来越引起人们的关注。世界卫生组织统计数据表明：80％以上早期恶性肿瘤可得到有效控制。越早确诊，肿瘤的治愈率就越高。目前，甲胎蛋白是肝癌早期诊断唯一的金标准，定期检测甲胎蛋白可以起到预防肝癌的作用。同时，可以作为肝癌手术预后的指标，进行后期的跟踪。肝癌分原发性和继发性两种，其中继发性肝癌是由于其它脏器的肿瘤经血液、淋巴或直接侵袭到肝脏所致。原发性肝癌又可分为肝细胞型，胆管细胞型和混合型三种类型，其中绝大多数为肝细胞型(Hepatocellularcarcinoma,HCC)。值得注意的是世界各地原发性肝癌发病率都有上升趋势,其中中国内地、东南亚及非洲是全球三个肝癌高发地区。据世界卫生组织统计，目前全球每年新发肝癌病例100万至150万例，每年有60万人死于肝癌(中国各占45％左右)。在我国，肝癌已经成为仅次于胃癌的第二大癌症。作为一种高死亡率的疾病，肝癌的病因、发生发展、复发、转移以及诊断和治疗都越来越引起人们的关注。肝癌的症状在早期很不明显，甚至患者在患病后较长时间毫无感觉，待病情发展到一定程度才会逐步产生一些肝区疼痛、食欲下降、疲乏无力、日渐消瘦等症状，到晚期则会有黄疸、腹水、呕血、昏迷等表现。肝癌病人的上腹部常可摸到巨大的肿块，但此时已到中晚期，甚至已向肺部等处转移。肝癌总的病程大约2年半时间，其中2年时间都是在没有症状的早期阶段，一旦出现症状就只有半年的存活时间。所以早期诊断成为防治肝癌最有效的手段之一。临床诊断肿瘤的方法可分为物理学、组织细胞学及生物化学三大类。常规的物理诊断如X光、CT、核磁共振、B超、红外扫描等只能发现直径1-2cm以上的肿块，而一个肿瘤倍增至如此大小约需5年甚至更长的时间。细胞病理学的检查需在物理学检查发现的基础上，通过手术取得标本进行检验。所以物理诊断和组织细胞学诊断往往只能发现中晚期病例，难以达到早期发现的目的。生物化学方法是检测肿瘤生长极其复杂的多病因过程的多种基因或/和蛋白等分子标志，该方法对肿瘤的早期诊断、观察评价治疗效果及判断预后具有极大意义。目前在大中型医院中，肿瘤因子的检测多是以化学发光免疫检测方法为主，该方法速度快、结果准确，但缺点是费用高，必须配备专门的大型检测仪器且检测试剂多为国外产品。而我国的医疗资源分布严重不均衡，广大农村及中西部欠发达地区医疗器械及人员严重不足，大型专门的检测仪器更是缺乏。由于缺医少药，很多疾病得不到有效的诊断和治疗，特别是癌症等疾病往往确诊时已到了晚期，严重影响了这些地区人民的生活质量。刚刚出台的新医保政策中着重强调了要改善农村医疗条件，提高农民健康水平。另外，随着经济的发展及生活水平的提高，人们对自身的健康越来越重视，定期进行身体检查已经成为趋势。因此，开发费用低廉、操作简便的检测仪器成为迫切需要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种甲胎蛋白检测试剂盒，本专利技术提供的甲胎蛋白检测试剂盒具有较高的灵敏度和准确度，用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。本专利技术提供了一种甲胎蛋白抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生。本专利技术提供了一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括：包被液、由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。其中，所述包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液。其中，所述封闭液为10％小牛血清。其中，所述洗涤液为0.10mol/LpH7.6磷酸盐缓冲溶液。其中，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。本专利技术获得了保藏编号为CGMCCNo.13808的AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，其产生的抗体可以用于检测AFP抗原，具有较高的灵敏度和准确度，用于肝癌早期诊断具有费用低廉、操作简便的优点。实验结果表明，本专利技术提供的试剂盒的最低检测限为2.108ng/mL，准确度和精密度的变异系数均小于10％。附图说明图1为本专利技术提供的检测标准曲线。保藏说明AFP小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株3D2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.13808，保藏日期为2017年3月10日，地址：北京是朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。具体实施方式实施例1单克隆抗体制备及特性分析1材料和方法1.1动物：7～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自河北省实验动物中心。1.2主要试剂和材料：小鼠SP2/0骨髓瘤细胞由本研究室保存。HAT、HT、PEG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。DMEM培养基、细胞培养板为GIBCO公司产品。HRP标记羊抗小鼠IgG为华美生物工程公司产品。所用化学试剂均为国产分析纯。1.3AFP抗原：Sigma公司产品，纯度>99％。1.4动物免疫：用三只BALB/c小鼠，首次基础免疫用弗氏完全佐剂与等体积AFP溶液(AFP用量为25μg/只小鼠)混合乳化后颈背部多点注射，7天后作第2次基础免疫，用弗氏完全佐剂与首次相同量抗原乳化后颈背部多点注射，15天后ELISA法测小鼠血清抗AFP效价，选一只最佳免疫小鼠融合前三天尾静脉注射抗原液10μg作加强免疫。1.5杂交瘤制备和筛选：取对数生长期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按常规方法用50％PEG进行融合。用间接ELISA检测培养上清，选择强阳性克隆，用有限稀释法连续克隆化3次，将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。1.6单克隆抗体的大量制备采用小鼠体内诱生腹水的方法，取健康的BALB/c雌性小鼠，每只小鼠体内注射石蜡油0.5mL，备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下，1000r/min离心5min，用不完全培养液悬浮细胞，将细胞个数调整到106/mL，每只小鼠腹腔注射1mL的阳性克隆杂交瘤细胞，7-9天取腹水，-20℃分装保存。1.7单克隆抗体腹水纯化采用辛酸-硫酸铵盐析法进行单克隆抗体的纯化，该方法是一个经典方法，辛酸在偏酸性的条件下能够将免疫球蛋白(IgG)以外的蛋白质都沉淀下来，上清中只剩下IgG。硫酸铵主要也是用于除去非IgG的杂蛋白。该种方法IgG的回收率能达到90％以上。具体操作如下：脱脂，取出的腹水经4℃放置12h后，10000r/min离心15min，去表面脂肪层取上清；取腹水5mL，加入0.06mol/LpH4.0NaAc-HAc缓冲液10mL，搅拌均匀；在室温下调pH值至4.8；向调好pH值的腹水加入165uL正辛酸，边搅拌边加入，搅拌30min，4℃静置2h以上；将腹水溶液4℃，6000r/min本文档来自技高网...

【技术保护点】
甲胎蛋白抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.13808的杂交瘤产生。

【技术特征摘要】
1.甲胎蛋白抗原的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生。2.一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括：包被液、由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生的抗体、甲胎蛋白抗原、封闭液、洗涤液、生物素标记的由保藏号为CGMCCNo.13808的杂交瘤产生的抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素、底物显色液和终止液。3.根据权利要求2所述的甲胎蛋白检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：许峰，程华，温占波，纪振动，郝鹏，范朝霞，
申请(专利权)人：河北渤腾医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13