一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述方法将流式细胞分选技术和高通量测序技术进行结合，其包括的步骤为：获得特定蛋白质W免疫和未免疫的羊驼外周血单个核细胞(PBMC)；采用流式细胞分选法获得针对特定蛋白质W特异的PBMC；提取未免疫、免疫后及分选后PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；以所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白质W的纳米抗体的DNA片段；构建纳米抗体的DNA片段的DNA文库，并进行高通量测序分析；分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度；和将所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。

Method for rapidly obtaining nano antibody by using high throughput sequencing technology

The present invention provides a method for quickly obtain nano antibody using high-throughput sequencing technology, the methods of flow cytometry sorting and high-throughput sequencing technologies are combined, which comprises the steps of: obtaining specific protein W immunized and nonimmunized Alpaca peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by flow cytometry; cell sorting obtained specific protein W specific PBMC RNA; total PBMC extraction is not immune, immune and sorting, and reverse transcription into cDNA; using the cDNA as template, PCR was amplified by two steps of nano antibody DNA fragment specific anti W protein; DNA nano antibody library construction DNA fragment, analysis and high-throughput sequencing; abundance analysis of the nano antibody DNA fragment; and the nucleotide sequence of the nano antibody DNA fragment was constructed into expression vector, and the nanometer Body DNA fragments are expressed in suitable hosts.

【技术实现步骤摘要】
一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法
本专利技术属于抗体
，尤其涉及一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。
技术介绍
抗体是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。1993年比利时的HamersCasterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条重链(H链)和2条轻链(L链)构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗(heavy-chainantibody，hcAb)，IgG2和IgG3亚型具有完全的抗原结合能力。这些重链抗体(HcAbs)在羊驼属(Lama)血清中约占总Ig的50％，在骆驼属(Camelus)血清中约占总Ig的75％。重链抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位，如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。另外，重链抗体还具有易表达，可溶性好，稳定性强，免疫原性弱，穿透性好等优点。已有的研究表明该重链抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、医疗领域、药物开发等领域有广阔的应用前景。目前获取纳米抗体最常用的方法是噬菌体抗体库筛选技术，该技术采用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示，将纳米抗体片段表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性纳米抗体。该技术构建的抗体库称为全套抗体库，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。噬菌体抗体库按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。噬菌体抗体库建库的主要步骤包括：首先分离外周血单个核细胞(PBMC)，提取细胞的RNA，经过RT-PCR扩增可变区基因，之后酶切插入噬菌体质粒(phagemid)，转化感受态细胞并扩大培养，获取噬菌体抗体库；之后采用合适的筛选步骤筛选特异性的抗体分子。抗体库的筛选方法主要有两类：一是将抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。虽然噬菌体抗体库技术具有一些明显的优点，如方法简单易行，可通过发酵生产来大量制备；筛选容量增大，可在数周内筛选100万～1亿个克隆，可获得高亲和力的抗体；直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，可以获得完全人源化的抗体；模拟体内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。然而，噬菌体抗体库技术也存在一些问题，如难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降等都需要改进。
技术实现思路
基于获取纳米抗体最常用噬菌体抗体库筛选技术的耗时长，筛选合适抗体困难，难于筛选到高亲和力的最佳抗体分子，难于构建库容大、多样性好的抗体库，长时间保存抗体库库容和多样性下降的缺点，本专利技术提供了一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法。所采用的技术方案如下：一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其步骤包括：A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。其中，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体恒定区序列设计的引物。进一步的，两步法PCR的第一步PCR的引物如SEQIDNO:1和2所示。所述步骤D)中，两步法PCR的第二步PCR的引物如SEQIDNO:3、4和5所示。所述步骤E)中DNA文库的构建步骤包括：a)PCR扩增获得的所述纳米抗体DNA片段的末端修复；b)步骤a)中所述修复的纳米抗体DNA片段与Adaptor连接；c)步骤b)中连接adaptor后的所述DNA片段的选择性回收；和d)以步骤c)中所述DNA片段为模板进行PCR扩增，并纯化所述PCR产物。所述步骤d)中使用的引物序列如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示。所述步骤G)中表达载体为pET28a。一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤A)中动物选自骆驼属或人。优选的，所述步骤A)中动物为羊驼或者骆驼。本专利技术的有益效果：本专利技术的高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法主要采用羊驼抗体组库利用高通量测序分析技术可以快速获得高特异性、高结合力(驼类)纳米抗体；本专利技术的方法简便、快速，动物免疫后，可在4周左右的时间内完成纳米抗体的筛选；工艺简单，成本低。本技术筛选的纳米抗体较常规抗体具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性好、易表达和免疫原性低等特点，比常规抗体用途更广。详细描述：纳米抗体：在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm,长4nm,分子量只有15KDa,此也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb)。PBMC是指外周血单个核细胞，英文全称为peripheralbloodmononuclearcell，指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。RNA是核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。cDNA指互补脱氧核糖核酸，与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的，就是cDNA。Adaptor指衔接子是一小段带有一个平端(与双链cDNA连接)和一个粘性端末(可与载体的相应末端连接)的双链核苷酸。它与双链cDNA连接后无需进行限制酶消化。就可以与载体相连接。附图说明：图1.为获得同一种抗体本专利技术技术与噬菌体展示库筛选技术比较。图2.为获得CD3e纳米抗体库第一步PCR电泳图。泳道1为扩增CD3e纳米抗体DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其包括的步骤为：A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。

【技术特征摘要】
1.一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，其包括的步骤为：A)获得特定蛋白质W免疫和未免疫的动物外周血单个核细胞(PBMC)，其中蛋白质W为任意蛋白；B)采用流式细胞分选法获得针对所述特定蛋白质W特异的PBMC；C)提取步骤A)中所述特定蛋白质W免疫的PBMC、未免疫的PBMC和步骤B)流式细胞分选的PBMC的总RNA，并反转录成cDNA；D)以步骤C)中所述的cDNA为模板，通过两步法PCR扩增获得抗特定蛋白W的纳米抗体的DNA片段；E)将步骤D)中PCR扩增获得所述纳米抗体的DNA片段的产物构建成DNA文库，并进行高通量测序分析；F)采用生物信息学方法及分析软件分析所述纳米抗体的DNA片段的丰度，纳米抗体的体细胞超突变和纳米抗体进化的谱系，并获得纳米抗体DNA片段的核苷酸序列；和G)将步骤F)中所述纳米抗体DNA片段的核苷酸序列构建入表达载体，并使所述纳米抗体DNA片段在合适的宿主中表达。2.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤B)采用生物素标记的特定蛋白质W分选特异的PBMC。3.如权利要求1所述的一种利用高通量测序技术快速获得纳米抗体的方法，所述步骤D)中，两步法PCR的第一步PCR的引物为根据纳米抗体序列的恒定区设计的引物。4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福胜，庄文超，李洪利，覃海兰，
申请(专利权)人：康众北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11