牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株及其应用制造技术

一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册的编号为CGMCC No. 12033。具有制备成本低，所得原料纯度高，可重复获得等特点，可以用于牛病毒性腹泻的免疫检测等技术领域，为奶牛、肉牛养殖该病防控提供方便的检测手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，涉及到一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株及其应用。
技术介绍
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)属于黄病毒科，瘟病毒属。BVDV感染牛后，其临床症状可表现为粘膜病、母畜流产，产死胎、畸形胎等，给养牛业造成了很大的经济损失。感染BVDV的怀孕母牛可能产生持续感染（Persistent Infection， PI）的犊牛，PI牛可以正常发育，但其生产性能低下，同时继续还向牛群散毒，导致牛场持续损失。据统计北京地区牛群中BVDV阳性率高达94.6%，而PI牛的阳性率也达到1.02%，每年由BVDV引起的牛群淘汰数量占据总体淘汰数量的30%。全国有超过22个省区报道过BVDV感染，而全世界每年因BVDV感染死亡的牛不少于500万头，由于持续感染导致的间接损失达数百亿美元。目前我国尚无有效应用的BVDV疫苗，该病在我国处于不断扩大的趋势。而BVDV除了在牛群中传播外，还会导致羊、猪、鹿等经济动物感染，整体防控形势非常严峻。传统的BVDV抗原检测主要依赖于分子检测方法，比如各种类型的PCR方法，其检测耗时，操作复杂，主要应用于出入境检验检疫、疾病控制预防中心等国家级实验室，无法在牧场和基层检测领域应用，因此有必要开发出一种能够现场使用的快速检测方法，满足实际生产需要。免疫胶体金技术和酶联免疫吸附试剂盒是当前应用最为广泛的快速方法，在食品检测、动物诊断、环境监测和水质分析等领域均有应用，尤其是胶体金免疫检测法检测速度快、灵敏度高、操作方便，无需特殊仪器设备，非常适合我国当前的动物养殖生产模式。而要建立这两种免疫检测方法，必须制备特异性好、灵敏度高的单克隆或多克隆抗体。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种制备成本低，所得原料纯度高，可重复获得的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株。本专利技术还要解决技术问题为提供上述牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株的应用为解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册的编号为CGMCC No. 12033。本专利技术的另外一个目的在于提供一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株的应用。一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由权利要求1所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株分泌产生的。进一步，牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体，其特征在于，制备该单克隆抗体所用基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，免疫蛋白的序列如SEQ ID No.2所示。进一步，本专利技术的目的还在于提供一种所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体在牛病毒病性腹泻病毒抗原检测中的应用。进一步，本专利技术的目的还在于提供所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株或所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体在制备检测牛病毒病性腹泻病毒试剂盒中的应用。此外，本专利技术还提供了一种利用牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体建立的牛病毒病性腹泻病毒抗原的检测方法，方法操作简易，适合于基层应用。为了达到上述目的，本专利技术采取了以下的技术措施：（1）通过重组表达的方式获得牛病毒病性腹泻病毒E0蛋白并纯化：根据GenBank公开的BVDV的E0基因序列设计引物，PCR扩增E0基因片段并与表达载体pFastBac HT-B连接。将阳性重组质粒pFastBac HT-E0转座DH10Bac感受态细胞，通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆，提取Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒。将重组杆状病毒以MOI 0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行。（2）利用重组E0蛋白免疫小鼠，筛选单抗：以纯化的E0蛋白为免疫抗原，以常规方法免疫Balb/C小鼠，多次免疫后测定血清效价，并加强免疫。随后取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，经过筛选得到了能分泌抗E0蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为MAB106，抗体亚型鉴定为IgG2b，分别以Western和ELISA鉴定抗体的特异性和灵敏度。（3）利用制备的单克隆抗体检测牛血清中的BVDV抗原：以双抗体夹心胶体金层析免疫为基础，将MAB106单抗用胶体金标记后，建立牛血清中BVDV病毒抗原的快速检测方法，为BVDV的临床诊断提供方法和手段。本专利技术的有益效果为：牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株。利用该细胞株培养或者免疫小鼠可以获得抗牛病毒性腹泻病毒的特异性单克隆抗体，具有制备成本低，所得原料纯度高，可重复获得等特点，可以用于牛病毒性腹泻的免疫检测等
，为奶牛、肉牛养殖该病防控提供方便的检测手段。保藏说明参据的生物材料（株）：MAB106科学描述：保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：CGMCC地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所保藏日期：2016年1月27日分类命名：杂交瘤细胞株保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 12033。附图说明图1：重组质粒pFastBac HT-E0的鉴定图2：重组E0蛋白纯化鉴定图图3：胶体金组装示意图背板1；金标垫2；样品垫3；硝酸纤维膜4；吸水垫5；质控线6；检测线7。具体实施方式以下为结合具体实施例来进一步描述本专利技术，这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本专利技术的保护范围之内，本专利技术实施例所用试剂，如未特殊说明，均购自生化试剂供应商，所用实验技术，如未特别说明，均为常规技术。实施例1：牛病毒性腹泻病毒的E0蛋白克隆表达纯化及抗体制备重组质粒构建参照GenBank中登录的BVDV基因序列设计引物，其上游引物E0-F为SEQ ID No.3所列的序列，其下游引物E0-R为SEQ ID No.4所列的序列，用于克隆E0基因片段，在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和Hind III 酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。E0基因片段以pUC-E0质粒为模板，用PCR 方法扩增。反应条件：94 ℃预变性5min；94 ℃变性45 s，退火条件为55. 6 ℃ 45 s ，72 ℃延伸2 min，30 个循环后， 再72 ℃延伸7 min，4 ℃终止反应。纯化的PCR 产物与表达载体pFastBac HT-B分别进行双酶切后，用T4 DNA 连接酶4 ℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞。阳性重组质粒命名为pFastBac HT-E0。蛋白纯化鉴定将阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞，通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆，提取Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒。将重组杆状病毒以MOI 0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行，纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量后分装，-80℃保存备用。纯化蛋白煮样后进行SDS-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,登记入册的编号为CGMCC No. 12033。

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,登记入册的编号为CGMCC No. 12033。2.一种牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由权利要求1所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体细胞株分泌产生的。3.根据权利要求2所述的牛病毒病性腹泻病毒特异性单克隆抗体，其特征在于，制备该单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦海涛，宋彦军，冯小宇，杨春江，赵荣茂，王林，马孝斌，梅力，于在江，雷琪莉，莫勋，李刚，高云玲，
申请(专利权)人：北京纳百景弈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11