马铃薯病毒病两步法多重RT-PCR固相化检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及两步法双重ＲＴ－ＰＣＲ同步检测马铃薯Ｙ病毒、马铃薯卷叶病毒，三重ＲＴ－ＰＣＲ同步检测马铃薯Ｘ病毒、马铃薯Ａ病毒、马铃薯Ｓ病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的５种马铃薯病毒而建立的一种同步检测２或３种病毒的快速方法，检测时间仅用４ｈ，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒－马铃薯卷叶病毒等缺点；该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用于田间复合侵染的马铃薯Ｙ病毒（简称ＰＶＹ）和马铃薯卷叶病毒（简称ＰＬＲＶ）的同步反转录两步法双重ＲＴ－ＰＣＲ固相化试剂盒，由以下各种检测试剂组成：样品病毒ＲＮＡ提取试剂，病毒ＲＮＡ反转录固相化试剂，ｃＤＮＡ扩增 固相化试剂，无害化ＰＶＹ和ＰＬＲＶ阳性对照品，健康马铃薯植株阴性对照品；其特征是，所述样品病毒ＲＮＡ提取试剂是０．４～０．５％曲拉通Ｘ－１００与０．３５～０．４５％ＮａＳＯ↓［３］在常温下的混合物；所述无害化ＰＶＹ和 ＰＬＲＶ阳性对照品由如下步骤制得：（１）接种马铃薯Ｙ病毒、马铃薯卷叶病毒于健康马铃薯植株上，（２）提取马铃薯Ｙ病毒和马铃薯卷叶病毒复合侵染后的病毒ＲＮＡ，（３）设计扩增５种马铃薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是５’ 端带有Ｔ７启动子序列，（４）进行双重ＲＴ－ＰＣＲ扩增得ＰＶＹ、ＰＬＲＶＤＮＡ片段混合物，（５）以ＰＶＹ、ＰＬＲＶＤＮＡ片段混合物为模板转录得ＰＶＹ、ＰＬＲＶＲＮＡ片段混合物；所述病毒ＲＮＡ反转录固相化试剂 、ｃＤＮＡ扩增固相化试剂分别是固相化混合物冻干胶珠；其中，病毒ＲＮＡ反转录固相化试剂由双重ＲＴ－ＰＣＲ同步反转录马铃薯Ｙ病毒和马铃薯卷叶病毒组成，该试剂中含有如下组分：组分终浓度５ｘ反转录缓冲液１Ｘ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］３～５ｍｍｏｌ／Ｌ，２５ｍＭｄＮＴＰｓ１．０～１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，４０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制剂５～１０Ｕｎｉｔ／１０ｕＬ，２００Ｕ／μＬＭＭＬＶ反转录酶５０～１００Ｕｎｉ ｔ／１０ｕＬ，２５μＭＰＶＹ：ＰＬＲＶ反义引物０．３０～０．５０：０．７０～０．９０，２５ｎｇ／μＬ待测样品或ＲＮＡ模板１．０～２．５μＬ，生物大分子稳定剂加至１０μＬ，所使用的反义引物为寡核 苷酸引物对：５’－ＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＧＣＣ－３’５’－ＴＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴ－３’（序号Ｎｏ．２），和寡核苷酸引物对：５’－ＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣ－３’５ ’－ＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴ－３；（序号Ｎｏ．３）；ｃＤＮＡ扩增固相化试剂由同步扩增马铃薯Ｙ病毒和马铃薯卷叶病...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王中康，殷幼平，袁青，夏玉先，彭国雄，曾德玉，曹月青，刘红光，
申请(专利权)人：重庆大学，重庆重大生物技术发展有限公司，四川渝高科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]