一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。所述杂交瘤细胞株3A2和4G8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：C201633和CCTCC NO：C201634，及其分泌的单克隆抗体Ab1和Ab5具有高特异性和高亲和力，能特异性结合人N端脑钠肽前体的不同抗原表位，可用于建立双抗体夹心ELISA检测方法对人血浆中N端脑钠肽前体定量检测。与进口试剂盒相比，本发明专利技术建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，可在临床上用于人血浆中N端脑钠肽前体检测，对心衰诊断具有重要的指导意义，具有商业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一对高特异性高亲和力抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。
技术介绍
人N末端B型脑钠肽前体(N-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NT-proBNP)是心肌细胞在合成多肽类激素B型脑钠肽(BNP)过程中产生的无生物活性的，由76个氨基酸组成的直链多肽片段。健康成年人血浆中NT-ProBNP含量较低，一般低于300pg/ml。随着心室的体积和压力增高可导致血浆内NT-ProBNP值升高，升高的程度与心室扩张和压力超负荷成正比，心衰患者血浆中NT-ProBNP含量甚至高达几十个ng/ml，NT-ProBNP含量能及时、特异地反应心脏结构和功能的变化。早在2002年，国际上已经公认NT-ProBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。2002年11月19日，FDA批准罗氏诊断试剂公司(RocheDiagnostics,Inc)开发的一种用于实验室帮助诊断充血性心力衰竭新的ElecsysproBNP酶联免疫检测试剂盒上市。目前，临床上主要是采用以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法来检测人N端脑钠肽前体，相关检测技术主要包括电化学发光、酶联免疫荧光法(ELFI)、放射免疫法(RIA)、高灵敏度的免疫放射法(IRMA)、微粒子酶免疫法(MEIA)，这些检测方法大都均依赖于国外进口大型贵重仪器试剂实现，患者使用成本高。因此，自主研发我国的NT-proBNP检测试剂盒，改变目前高端临床诊断试剂几乎完全依赖国外进口产品的状况，具有非常重要的临床应用价值和经济价值。双抗体夹心ELISA由于其灵敏度高、特异性强，适用于同时检测多个样本，并且操作简单，不需要特殊的仪器设备等优点而得到广泛应用。本研究通过高亲和力、高特异性的抗人N端脑钠肽前体的单抗的制备，筛选能配对的抗体，结合ELISA灵敏度高、特异性强、定量准确、操作简单等特性，建立双抗体夹心ELISA检测方法，为快速可靠的人N端脑钠肽前体的免疫学检测奠定基础。用于双抗体夹心ELISA的抗体除了具备高特异性、高亲和力之外，还要能识别同一抗原的不同表位。此外，两株抗体不仅要求能识别免疫原，而且需要能与样本中的天然抗原起反应。因此，制备的单克隆抗体的质量是成功研发双抗体夹心ELISA试剂盒的关键。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中人N端脑钠肽前体检测技术存在的缺陷和不足，提供一对靶向人N端脑钠肽前体(N-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NT-proBNP)不同表位的鼠源性单克隆抗体，该对抗体能高亲和力、高特异性的结合人N端脑钠肽前体的不同抗原表位，建立双抗体夹心ELISA检测方法对人血浆中N端脑钠肽前体定量检测。本专利技术的目的在于提供一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体。本专利技术另一目的在于提供分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术所采取的技术方案是：一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1或Ab5，单克隆抗体Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；所述单克隆抗体Ab5的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。进一步的，所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.2所示；所述单克隆抗体Ab5重链可变区的基因序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.4所示。进一步的，所述单克隆抗体Ab1由杂交瘤细胞株3A2分泌产生，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201633；所述单克隆抗体Ab5由杂交瘤细胞株4G8分泌产生，杂交瘤细胞株4G8于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201634。上述任一项所述的单克隆抗体在制备检测人血浆中N端脑钠肽前体的试剂或试剂盒中的应用。一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA，该试剂盒中含有上述任一项所述的单克隆抗体Ab1和Ab5。一种杂交瘤细胞株3A2，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201633。杂交瘤细胞株3A2在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。一种杂交瘤细胞株4G8，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201634。杂交瘤细胞株4G8在生产抗人N端脑钠肽前体的单克隆抗体中的应用。一种检测人血浆中N端脑钠肽前体的双抗体夹心ELISA方法，该方法以上述任一所述的单克隆抗体Ab1作为检测抗体，以上述任一所述的单克隆抗体Ab5作为捕获抗体，该方法用于非疾病的诊断的治疗。本专利技术的有益效果是：1)本专利技术公开了能特异性结合人N端脑钠肽前体的鼠源性单克隆抗体Ab1和Ab5，该对抗体能特异性结合人N端脑钠肽前体的不同表位，形成双抗体夹心模式，实现人血浆中的N端脑钠肽前体的定量检测，可在临床上用于人血浆中N端脑钠肽前体的检测，对心衰的早期诊断具有重要的指导意义。2)以Ab1作为检测抗体，Ab5作为捕获抗体建立的双抗体夹心ELISA方法具有很好的检测特异性和灵敏度。检测灵敏度与进口试剂盒比较相近，而本专利技术建立的双抗体夹心ELISA方法具有更大的线性范围，具有推广应用的商业价值。3)本专利技术通过大量的研究和探索，得到了6株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，其中细胞株3A2和4G8分别分泌的Ab1和Ab5这两株高特异性、高亲和力的单抗能形成配对，且Ab1/HRP-Ab5这个配对组合有较高的灵敏度和较大的线性范围；利用最佳配对组合Ab1/HRP-Ab5建立标准曲线，以Ab1作为检测抗体，Ab5作为捕获抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，其线性范围为300pg/ml～9600pg/ml，优于进口试剂盒的线性范围31pg/ml～300pg/ml。4)样本检测结果显示，本专利技术的双抗体夹心ELISA方法对人N端脑钠肽前体的阳性检出率为97.5％，阴性检出率为100％，因此可以明确，本专利技术得到了2株高特异性，高亲和力的抗人N端脑钠肽前体单克隆抗体，可用于夹心ELISA试剂盒的研制。附图说明图1为纯化后单克隆抗体Ab1～Ab6的SDS-PAGE检测；图2为腹水型单克隆抗体Ab1～Ab6的效价检测；图3为单克隆抗体Ab1～Ab6的亚型检测；图4为6株单克隆抗体Ab1～Ab6的交叉反应检测；图5为不同配对抗体组合对抗原检测的效果；图6为抗hNT-proBNP单克隆抗体Ab1、Ab5的亲和力测定曲线；图7为单克隆抗体Ab1重链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；图8为单克隆抗体Ab1轻链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；图9为单克隆抗体Ab5重链可变区的3个CDR(互补决定簇)区；图10为单克隆抗体Ab5轻链可变区的3个CDR(互补决定簇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1或Ab5，单克隆抗体Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述单克隆抗体Ab5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，该单克隆抗体为Ab1或Ab5，单克隆抗体Ab1和Ab5的可变区基因均包括重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体Ab1重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；所述单克隆抗体Ab5的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。2.根据权利要求1所述的一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体Ab1重链可变区的基因序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.2所示；所述单克隆抗体Ab5重链可变区的基因序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区的基因序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1~2任一项所述的一种高特异性高亲和力结合人N端脑钠肽前体的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体Ab1由杂交瘤细胞株3A2分泌产生，杂交瘤细胞株3A2于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201633；所述单克隆抗体Ab5由杂交瘤细...

【专利技术属性】
技术研发人员：向军俭，黄建芳，刘诗琴，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44