一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法技术

本发明专利技术属于生物医药检测领域，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法。本发明专利技术公开了一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，通过两部特异性磁珠筛选，获得了肿瘤特异性TIL细胞。本发明专利技术方法操作简单，能高效地增殖培养出肿瘤特异性TIL细胞，大大提高了TIL细胞的杀瘤效果，同时采用无血清培养解决现有技术中潜在传播病毒和其他危险的风险，为其今后的广泛应用提供了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法。
技术介绍
肿瘤过继免疫治疗（adoptiveimmunotherapy，ACI)是指通过向肿瘤患者输注具 有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的 目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子（IL2、 干扰素）刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK细胞、肿瘤浸 润性淋巴细胞（TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokineinducedkillcells，CIK)等； 特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细 胞（DC)，细胞毒T淋巴细胞（CD8+细胞）等。ACI在恶性实体肿瘤治疗中的应用已引起了 人们的普遍关注。 HL细胞是特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，其杀瘤活性较LAK细胞强50~100 倍；TIL细胞疗法是一种特异性免疫活性细胞疗法，尽管其用于肿瘤治疗领域已有20多年 的历史，但至今一直有新技术、新成果在不断报道。2004年SteveRosenberg教授在PNAS 上发表文章指出：肿瘤特异性的TIL治疗转移性黑色素瘤的临床有效率大于50%，35个病 人中18名病人有响应，其中4人完全响应。TIL因其对肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作 用，因而一直是国内外恶性肿瘤生物治疗的热点之一。 但是TIL细胞制备技术复杂，通常需要筛选上百个甚至几百个T淋巴细胞克隆才 能得到肿瘤特异性的TIL细胞，同时目前，体外培养TIL细胞主要还是用含有人血清或FBS 的培养基，使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏 症的发生，而使用人AB血清的供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。这些因素严重 地限制了其的应用和有效性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供简便、有效的肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，以克服现 有技术的缺陷。 为此，本专利技术公开了一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，其包括下列步骤： 无菌条件下制备固体肿瘤单细胞悬液或采集恶性胸腔积液或腹水； 采用淋巴细胞分离液离心，收集含淋巴细胞的云雾状细胞层； 云雾状细胞层用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞； 按IX106/ml的浓度将细胞悬于无血清培养液中，接种于细胞培养瓶或培养皿中 而后置于饱和湿度、37°C、5% 0)2的培养箱中静置培养，24小时后取出，收集悬浮细胞； 悬浮细胞采用磁珠分离仪分离⑶8+T细胞； CD8+T细胞采用磁珠分离仪分离CD8+PD-1+T细胞； ⑶8+PD_l+T细胞用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞； 按0.5-2.OXIO6Ail的浓度将⑶8+PD-l+T细胞悬于无血清培养液中，培养的第1天 无血清培养液加入终浓度为lOU/ml的IFN-y、100ng/ml的PHA，40-50U/ml的IL-2 ;而后 隔1~2d加入含有IL-2 100U/ml的无血清培养液连续培养5-7天； 含有IL-2lOOOU/ml的无血清培养液下每隔2-3天传代培养，15-20天即可收集细 胞； 所述无血清培养液包括基础培养基、维生素类物质、微量元素、2-巯基乙醇、丙谷 二肽和甘油酯；其中基础培养基是Iscove'sModifiedDulbecco'sMedia、或者是RPMI-1640,或 者是Dulbecco'sModifiedEagleMedium和Ham's_F12按照1:1的体积比例混合而成的。 在一些实施例中，其中维生素类物质含量为生物素1-5yM;肌醇0. 1-0. 2mM;叶酸 0. 01-0. 02mM;烟酸 0. 03-0. 05mM;砒洛醇 7-10yM;叶黄素 0. 5-1yM;硫铵 7-10yM;维生素 B12 0? 3-0. 9yM;泛酸钙 0? 01-0. 03mM。 微量元素：腐胺0.OlmM;乙醇胺0.ImM;亚油酸0.OOlmM;柠檬酸铁10mg/L;硫 酸铜0? 05-0.IyM硫酸锌5-10yM;硒酸钠0? 01-0.IyM;氯化铝0? 05-0. 01yM;碘化钾 0? 04-0. 06yM;氯化钴 0? 03-0. 07yM。 其中2-巯基乙醇的含量为L0-5. 0yg/ml; 其中丙谷二肽的含量为0? 5-3mM。 本专利技术方法操作简单，能高效地增殖培养出肿瘤特异性TIL细胞，大大提高了TIL 细胞的杀瘤效果，同时采用无血清培养解决现有技术中潜在传播病毒和其他危险的风险， 为其今后的广泛应用提供了基础。【附图说明】 图1，不同培养基体外CD8+PD-1+T细胞增殖比较。【具体实施方式】 除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将 为本领域技术人员所了解。 参考例如标准手册，为进一步详细描述在本专利技术的实践中所使用的常规技术， 实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括 Teratocarcinomasandembryonicstemcell:Apracticalapproach;GuidetotechniquesinMouseDevelopment!EmbryonicStemCellDifferentiationinVitro!PropertiesandusesofEmbryonicStem Cells:ProspectsforApplicationtoHumanBiologyandGeneTherapy 〇 细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在"蛋白科学中的当前方案" 、"细胞生物学中的当前方案" 和"兔疫学功时当亦方案" 中找到。与 本专利技术相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、 Stratagene、InvitrogeruClonTech以及sigma-Aldrich公司。 细胞培养方法通常在"动物细胞培养：基本技术手册"最新版本（R.I.Freshney编 辑，Wiley&Sons)细胞培养一般技术"(M.A.Harrison和I.F.Rae,剑桥大学出版）；和"胚 胎干细胞：方法和操作规定"(K.Turksen编辑，Humana出版）中有描述。组织培养基和试剂 可从商业供应商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-NuncInternational、SigmaChemical Co.、以及ICNBiomedicals。以及本文中引用的一般现有技术； 此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已 经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述 一般现有技术及其中引用的其他参考文献.以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这 些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 一、材料与方法( -）材料收集 从上海医院收集6例晚期肿瘤患者（2例肺癌、1例肝癌、1例胃癌、1例十二指肠腺 癌）的胸腔积液或腹水各200ml(肝素抗凝5U/ml)，立即进行分离制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤特异性TIL细胞的培养方法，其包括下列步骤：a)无菌条件下制备固体肿瘤单细胞悬液或采集恶性胸腔积液或腹水；b)采用淋巴细胞分离液离心，收集含淋巴细胞的云雾状细胞层；c)云雾状细胞层用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；d)按1×106/ml的浓度将细胞悬于无血清培养液中，接种于细胞培养瓶或培养皿中而后置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，24小时后取出，收集悬浮细胞；e)悬浮细胞采用磁珠分离仪分离CD8+T细胞；f)CD8+T细胞采用磁珠分离仪分离CD8+PD‑1+T细胞；g)CD8+PD‑1+T细胞用无菌缓冲液洗一次，再用无血清培养液洗一次，离心收集细胞；h)按0.5‑2.0×106/ml的浓度将CD8+PD‑1+T细胞悬于无血清培养液中，培养的第1天无血清培养液加入终浓度为10U/ml的IFN‑γ、100ng/ml的PHA,40‑50U/ml的IL‑2；而后隔1～2d加入含有IL‑2100U/ml的无血清培养液连续培养5‑7天；i)含有IL‑21000U/ml的无血清培养液下每隔2‑3天传代培养，15‑20天即可收集细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱兆与，
申请(专利权)人：上海鑫宸医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31