一种非接触式细胞三维共培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞、组织工程等领域，是一种非接触式细胞三维共培养方法，即在培养板的培养孔中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成三明治式复合凝胶，不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，不同细胞的非接触三维共培养，进而调控共培养体系中目的细胞的增殖、分化等行为。本发明专利技术操作简单，成本低，通过将可能相互影响的不同细胞进行三维共培养，最大限度地模拟体内复杂的细胞生存环境。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞、组织工程等领域，是。
技术介绍
细胞共培养是通过一些特殊的培养技术所建立的体外培养方法，它可以最大程度地在体外模拟体内组织环境、维持多种细胞在体内的性状，观察细胞之间相互作用，调控细胞的行为。由于它保留了体内组织微环境的结构和作用基础，又体现了体外培养条件的可控性，因此是组织工程研究的热点，在科研以及临床等领域具有广阔的研究和应用前景。实现细胞共培养的方法主要有直接接触共培养和非接触共培养。直接接触共培养是将不同类型 的细胞在同一个培养体系中混合在一起进行共同培养，不同类型的细胞发生直接接触，不能彻底分开，因此存在着细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等问题，不适合临床应用。非接触共培养是使用半透膜等起分隔作用的薄膜将两种细胞分隔开进行共培养，起到隔离作用的分隔薄膜允许细胞分泌的生长因子自由交换，同时将不同类型的细胞进行了免疫隔离，有利于细胞分离，提高了安全性。由于非接触共培养体系中不同类型细胞间的相互作用是通过可溶性生长因子介导的，因此非接触共培养体系中分隔薄膜截留分子量影响了不同分子量的可溶性因子通过分隔薄膜的扩散情况，截留分子量较大，较多种类的小分子量可溶性因子可以自由交换；截留分子量较小，较多种类的大分子量的因子则不能透过分隔薄膜。因此，分隔薄膜截留分子量的变化改变了共培养体系中起介导作用的可溶性因子的种类和分布，从而调控了不同类型细胞之间的相互作用。另外，细胞在体内组织中是以三维状态生长的，研究表明传统的体外二维培养条件下的细胞不能真实反映体内细胞的形态、功能等特点，由此可知，需要发展可实现多种细胞三维非接触共培养的有效方法来调控共培养中目的细胞的多种行为。然而，目前非接触共培养的常用方法是使用transwell小室，这种培养方法存在明显的缺点:1)价格昂贵，实验成本增加；2)只能实现细胞在二维条件下的共培养；3)不能控制膜的截留分子量；4) transwell体系基于24孔板或6孔板，不容易扩大规模。由于现有细胞共培养方法存在缺陷，限制了细胞共培养研究的发展，因此急需研发一种便捷实用的非接触式细胞三维共培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，从而实现调控共培养体系中目的细胞的多种行为。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:在培养容器中依次制备 海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，两种不同细胞的非接触三维共培养；或，在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成五层的三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种或三种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，三种不同细胞的非接触三维共培养，进而调控共培养体系中目的细胞的增殖、分化等行为。所述三明治式复合凝胶为由海藻酸钠和壳聚糖所制备，可支持两种或三种细胞三维共培养；其中，海藻酸钠分子量范围为IOO-1OOOkDa,古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范围为0.2-3 ;壳聚糖分子量范围为2-200kDa，脱乙酰度范围为50-100%。所述截留分子量可控的壳聚糖膜为通过改变海藻酸钠或壳聚糖的分子量、浓度或作用时间来改变壳聚糖膜的截留分子量；所述海藻酸钠和壳聚糖为经过细胞外基质主要成分(胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、聚糖)来源的多肽化学修饰的改性海藻酸钠和壳聚糖。多肽包括精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)、苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-色氨酸-丝氨酸_谷酰胺(TTSWSQ)、纟颜氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸_天冬酰胺_苯丙氨酸_纟颜氨酸_売氨酸-赖氨酸(VFDNFVLK)、苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)；所述三维共培养为静态或者动态条件下的细胞三维共培养。所述不同细胞的非接触三维共培养为存在可能相互影响的二种或三种不同种类的细胞在复合凝胶中的三维共培养。所述二种或三种不同种类的细胞包括下述组合之一，多来源干细胞和多来源体细胞之间、多来源体细胞自 身之间、以及多来源干细胞或体细胞和转基因细胞或细胞株之间的共培养。其中，多来源干细胞，包括胚胎干细胞或成体干细胞；多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞株是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。所述两种或三种不同细胞的非接触三维共培养，进而调控共培养体系中目的细胞的增殖、分化等行为(图1)。所述共培养体系中细胞的增殖、定向分化等行为指共培养体系中细胞出现的增殖、分化、迁移、组织化、或凋亡的行为。所述培养容器中为培养板的培养孔中。本专利技术具有如下优点:1.操作简单，成本低，本专利技术利用复合凝胶作为细胞三维共培养的载体，容易制备，避免使用昂贵材料和工艺；2.复合凝胶中的海藻酸钙凝胶层给内部细胞提供了三维生长环境，且多种细胞三维共培养最大限度模拟了细胞在体内的真实生存状态；2.复合凝胶中间的壳聚糖膜的截留分子量可以改变，以调控不同类型细胞分泌的不同分子量可溶性因子的种类和分布，达到控制细胞间相互作用的目的；3.壳聚糖膜可使营养物质、代谢产物以及细胞分泌的可溶性因子等进行交换，同时又能将不同类型的细胞进行免疫隔离，不直接接触，有利于不同类型细胞的分离和收获，更好地保证了生物安全性；4.本专利技术不但在常规静态培养下能实现对细胞行为的调控，还可以应用到动态共培养体系中，利于规模化放大；5.应用范围广，本专利技术方法可适用于多来源细胞(干细胞、体细胞、转基因细胞以及细胞株等)之间进行共培养，可应用于控制细胞在三维条件下的增殖、分化、迁移、组织化、凋亡等多种行为。附图说明图1为非接触式细胞三维共培养方法的示意图:图中培养孔1，培养液2，海藻酸钙凝胶层3，细胞类型一 4，海藻酸钙凝胶层5，细胞类型二 6，壳聚糖膜层7 ；图2为三维共培养体系中骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞分别在海藻酸钙凝胶层中的电镜照片(X 1000，Day 2): (A)骨髓间充质干细胞；(B)血管内皮细胞；图3为三维共培养体系中被诱导细胞胞内碱性磷酸酶活性和骨钙素合成(Day7): (A)碱性磷酸酶活性；(B)骨钙素合成；图4为初始接种时以及二维和三维共培养条件下肾上皮细胞的活性照片(Xioo):(A)初始接种细胞(Day O) ； (B) 二维共培养(Day 14) ； (C)三维共培养(Day14)；图5为初始接种时(Day O)以及二维和三维共培养(Day 14)条件下肾上皮细胞凋亡和死亡比例:⑷；细胞凋亡比例⑶；细胞死亡比例。具体实施例方式实施例1:共培养体系调控骨髓间充质干细胞三维定向分化为成骨细胞首先，制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠(分子量430kDa，古罗糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非接触式细胞三维共培养方法，其特征在于：在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，两种不同细胞的非接触三维共培养；或，在培养容器中依次制备海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层、壳聚糖膜层、海藻酸钙凝胶层，即形成五层的三明治式复合凝胶；在制备海藻酸钙凝胶层过程中，将二种或三种不同的细胞分别三维生长在复合凝胶中截留分子量可控的壳聚糖膜两侧的海藻酸钙凝胶层中，并于培养容器中添加培养液，从而实现在同一个培养体系中，三种不同细胞的非接触三维共培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马小军，宋益哲，刘洋，张英，孙广炜，王为，于炜婷，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21