化学成分确定的无血清细胞培养基制造技术

本发明专利技术提供了用于培养例如间充质干细胞等细胞的含有营养和生长因子且不含任何血清的化学成分确定的细胞培养基的实施方式，和利用所述细胞培养基的实施方式来扩增例如间充质干细胞等细胞群并同时保持多能表型的方法，以及通过在所述细胞培养基的实施方式中混入分化因子从而诱导间充质干细胞的软骨发生和骨发生的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体涉及用于细胞培养的化学成分确定的无血清细胞培养基。具体而言，本专利技术涉及用于培养间充质干细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基，所述培养基可用于扩增并同时保持可获取软骨细胞和骨细胞的多能表型，本专利技术还涉及利用这群扩增的间充质干细胞群治疗受益于施用治疗量的这种扩增和分化的间充质干细胞群的疾病的方法。
技术介绍
在整形外科中、创伤外科中或摘除肿瘤病灶后的骨和软骨片段的重构中都要进行骨和软骨的移植。目前，用于该目的的是自体来源的或者来自活着或死亡的捐献者的人体组织。随着干细胞研究的进展，源自间充质干细胞的骨和软骨细胞正成为用于骨骼修复的细胞来源。间充质干细胞(MSC)可见于身体的某些组织中，例如骨髓、血液、真皮和骨膜中。它们具有分化为其它类型的细胞的能力，因此可有助于损伤后组织的愈合。MSC可以从骨髓中分离纯化并在体外培养扩增。 目前，MSC的体外扩增是在补充有胎牛血清(下文中称作“FBS”)或补充有人的自体血清或基本相似或等同的血清(也称为“血清”)的培养基中进行。然而，从MSC培养物的潜在治疗应用的角度来看，MSC培养物中存在动物或人血清具有某些弊端和局限。首先，牛血清、人血清或其它动物血清可能含有血液传播的病原体,例如病毒和疯牛病朊病毒、牛海绵状脑病(“BSE”)等。其次，牛血清会激发抗异型生物质蛋白的抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答。第三，牛血清显示出批间差异，可导致不一致的性能。显然，如果本专利技术的细胞培养基和使用本专利技术的细胞培养基的方法能够实现包括MSC在内的细胞的扩增并进而实现MSC在培养物中的分化，那么仅含有化学成分确定的物质且不含血清和异型生物质的细胞培养基对MSC(以及其他细胞)的培养而言将非常理想。
技术实现思路
因此，本专利技术的主要目的可以是提供用于细胞培养的化学成分确定的专利技术性无血清培养基(也称为“无血清培养基”)的一种或多种实施方式，并且涉及用于体外扩增MSC群(包括但不限于人MSC( “hMSC”))的该专利技术性无血清培养基的具体的非限制性实施方式。本专利技术的另一主要目的可以是提供含有化学成分的组合的无血清培养基的实施方式，所述化学成分能够支持MSC在离体体外细胞培养物中的、特别是在不含任何血清(例如胎牛血清、自体血清或其它动物血清)的MSC体外培养物中的活力、增殖和分化。另外，本专利技术的培养基的实施方式可用于支持MSC的活力、增殖和分化，其效果或结果与含有血清的常规细胞培养基相比基本相似或更好。本专利技术的另一主要目的可以是在导致MSC群扩增和MSC分化以产生软骨细胞或骨细胞的本专利技术的培养基中培养细胞(例如MSC，特别是人MSC)的方法。本专利技术的又一主要目的可以是在带负电的塑料表面(例如带负电的聚苯乙烯塑料表面)上培养细胞(例如MSC)的方法，该方法避免了以纤连蛋白等包被表面的步骤。当然，本专利技术的其它目的在说明书的其它部分、附图、照片和权利要求中都有公开。附图说明图1提供了 对在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC和在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC的细胞培养物形态学进行比较的图。图2是细胞数量对天数的作图，该图比较了在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的生长速率和在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC的生长速率。图3是细胞数量对传代数的作图，该图比较了每次分瓶(split)时的hMSC总数，其中，起始传代数为4，从含10%FBS的常规培养基进入本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中或进入含10%FBS的常规培养基中。图4提供了对在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC和在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的集落形成能力进行比较的图。图5提供了对在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中长期培养后的hMSC和在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的多向分化潜能进行比较的图。图6是细胞数量对传代数的作图，该图显示出，在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中的hMSC的生长速率在使用和未使用培养容器上的平板包被层的情况下都相似。图7是细胞数量对传代数的作图，该图比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基的实施方式中培养的源自脐带血的MSC的生长速率与在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养的源自脐带血的MSC的生长速率。图8是细胞数量对传代数的作图，该图比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中培养的源自脂肪组织的MSC的生长速率与在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养的源自脂肪组织的MSC的生长速率。图9是在本专利技术的无血清培养基的特定实施方式中培养hMSC时总细胞数对所用的培养瓶的类型的柱状图。具体实施例方式本专利技术涉及用于培养细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基。具体而言，本专利技术涉及用于培养间充质干细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基，所述培养基可用于单个核细胞(mononuclear cell)的离体扩增并同时保持多能表型，其中软骨细胞和骨细胞可源自所述间充质干细胞。本专利技术还涉及利用化学成分确定的无血清细胞培养基使体外扩增的间充质干细胞群分化为软骨细胞和骨细胞并治疗可受益于所获取的软骨细胞或骨细胞群的骨和软骨疾病的方法。对于本专利技术，术语“无血清”表示不存在任何物种的任何血清，包括但不限于，不存在胎牛血清、小牛血清或人血清等或者它们的组合。对于本专利技术，无论是否明确指出，本文中所有数值均设定为由术语“约”修饰。对于本专利技术，各范围可以表示为从“约”一个具体值至“约”另一个具体值。当表述了这样的范围时，另一实施方式包括从所述一个具体值至所述另一个具体值。通过端点来描述的数值范围包括了该范围内所含的所有数值。例如，I至5的数值范围包括了数值1、1. 5、2、2. 75、3、3. 80、4和5等。还应该理解的是,每个范围的端点不论相对于另一个端点还是独立于另一个端点都具有显著意义。当利用了在前的“约”来将一个值表示为近似值时，应该理解的是，该特定值构成了另一实施方式。对于本专利技术，术语“组合”是指将两种以上材料合在一起的任何方法。所述方法包括但不限于混合、共混、掺和、调混、匀化、合并、掺混或搅拌等。对于本专利技术，术语“ 一个”或“ 一种”事物是指一个/种或多个/种该事物；例如，“一种蛋白”或“一种肽”是指一种或多种所述化合物或至少一种化合物。这样，术语“一个”或“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。此外，“选自由……组成的组的”化合物是指其中所列的一种或多种化合物，包括两种以上这些化合物的组合。根据本专利技术，分离的化合物是已从其天然环境中取出的化合物。这样，“分离的”不必反映出该化合物的纯化程度。本专利技术的分离的化合物可从其天然来源获得，可利用分子生物学技术来制备，或者可以通过化学合成来制备。另外，虽然描述了本专利技术实施方式的特定成分或要素的某些来源以及这些成分或要素的具体产品号，但本专利技术并不限于此，而且，适合用于本专利技术实施方式的相同、等同或基本相似的成分或要素可以从多种多样的来源获得。包括本专利技术最佳模式的本专利技术的培养基的实施方式可提供无血清的基础培养基(也称为“基础培养基”)。无 血清的基础培养基可包括Dulbecco本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.17 US 61/397,8471.一种化学成分确定的无血清细胞培养基，其包含 a)基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和 b)基础培养基补充剂，其包含 i) 一种或多种细胞生长因子； ) 一种或多种磷脂生长因子；和 iii) 一种或多种WNT信号传导途径激活剂。2.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基包含一定量的DMEM和一定量的MCDB，其中DMEM与MCDB之比为约O. 75:1. 25v/v至约1. 25:0. 75v/v03.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述DMEM与MCDB之比选自由下述范围组成的组:约O. 75:1. 25至约O. 85:1. 15，约O. 80:1. 20至约O. 90:1. 10，约 O. 85:1. 15 至约 O. 95:1. 05，约 90:110 至约1. 05:0. 95，约1. 00:1. 00 至约1. 10:0. 90，约1.05:0. 95 至约1. 15:0. 85，约1. 10:0. 90 至约1. 20:0. 80，和约1. 15:0. 85 至约 125:0. 75。4.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种细胞生长因子选自由胰岛素、bFGF、PDGF-bb, EGF, TGF- β I和IGF-1组成的组。5.如权利要求4所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述胰岛素在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约4mg/L至约6mg/L。6.如权利要求5所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、H)GF-bb、EGF,TGF-β I和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约Ing/mL 至约 20ng/mL。7.如权利要求6所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、H)GF-bb、EGF,TGF-β I和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度选自由下述范围组成的组约Ing/mL至约4ng/mL,约3ng/mL至约5ng/mL,约4ng/mL至约6ng/mL,约 5ng/mL 至约 7ng/mL,约 6ng/mL 至约 8ng/mL,约 7ng/mL 至约 9ng/mL,约 8ng/mL 至约10ng/mL,约 9ng/mL 至约 I Ing/mL,约 10ng/mL 至约 12ng/mL,约 I Ing/mL 至约 13ng/mL,约12ng/mL 至约 14ng/mL,约 13ng/mL 至约 15ng/mL,约 14ng/mL 至约 16ng/mL,约 15ng/mL 至约 17ng/mL,约 16ng/mL 至约 18ng/mL,约 18ng/mL 至约 20ng/mL,和约 19ng/mL 至约 20ng/ml8.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子选自由LPA和SlP组成的组。9.如权利要求8所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度为约IOOnM至约200ηΜ。10.如权利要求9所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度选自由下述范围组成的组约IOOnM至约120ηΜ，约11OnM 至约 130ηΜ，约 120ηΜ 至约130ηΜ 至约 150ηΜ，约 140ηΜ 至约 160ηΜ，约 150ηΜ至约 170ηΜ，约 160ηΜ 至约 180ηΜ，约 190ηΜ 至约 200ηΜ。11.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂选自由人WNT3A和RSPOl组成的组。12.如权利要求11所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂在所述基础培养基中的浓度为约20ng/mL至约200ng/mL。13.如权利要求12所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂包含浓度为约20ng/mL的人WNT3A和浓度为约40ng/mL的RSPOl的组合。14.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种类固醇。15.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇选自由地塞米松和氢化可的松组成的组。16.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇包含浓度为约2. O μ g/mL至约5. O μ g/mL的所述地塞米松和浓度为约O. 5mg/mL至约1. 5mg/mL的所述氢化可的松的组合。17.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含调控铁源。18.如权利要求17所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述调控铁源包含一定量的转铁蛋白，所述转铁蛋白在所述基础培养基中的浓度为约2mg/L至约10mg/L。19.如权利要求18所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，转铁蛋白的浓度选自由下述范围组成的组约2mg/L至约4mg/L,约3mg/L至约5mg/L,约4mg/L至约6mg/L,约 5mg/L 至约 7mg/L,约 6mg/L 至约 8mg/L,约 7mg/L 至约 9mg/L,约 8mg/L 至约 10mg/L。20.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含电子传递激活剂。21.如权利要求20所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述电子传递激活剂选自由一定量的硒和一定量的亚硒酸组成的组。22.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的HSA。23.如权利要求22所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA在所述基础培养基中的浓度为约100 μ g/mL至约350 μ g/mL。24.如权利要求23所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA包含一定量的重组HSA。25.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种抗氧化剂。26.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述抗氧化剂选自由α -生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯组成的组。27.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含量为约O.OOlg/L至约O. 003g/L的5-羟色胺。28.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含缓冲剂。29.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述缓冲剂包含量为约3. 2g/L至约4. 2g/L的碳酸氢钠。30.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的TGFB1，所述量的TGFBl对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。31.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的BMP2，所述量的BMP2对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。32.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基由以下a)至I)组成a)量为约O. 5L/L 的 MCDB201 ；b)量为约O. 5L/L 的 DMEM ； c)量为约3.7g/L的碳酸氢钠； d)量为约O.25g/L的重组人血清白蛋白； e)量为约O.005g/L的转铁蛋白； f)量为约O.005g/L的胰岛素； g)量为约O.0000037g/L的亚硒酸； h)量为约O.032205g/L的抗坏血酸_2_磷酸酯； i)量为约O.002127g/L的5-羟色胺； j)量为约O. 000003925g/L的地塞米松； k)量为约O. OOlg/L的氢化可的松；和 I)量为约O. 0002g/L的α -生育酚乙酸酯。33.如权利要求32所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂由以下a)至h)组成 a)量为约...

【专利技术属性】
技术研发人员：安松柱，朱亚楠，
申请(专利权)人：思迪公司，
类型：
国别省市：