本发明专利技术公开了一种BHK-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用，包括有以下步骤：1）细胞复苏；2）反应器培养及细胞放大培养；3）接种口蹄疫病毒种毒液及毒液收获。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的无血清悬浮培养BHK-21细胞生产口蹄疫灭活疫苗的工艺及细胞逐级放大的方法，使口蹄疫疫苗生产的周期缩短，产量增加，质量稳定，效益显著。本发明专利技术提供的生产工艺降低了培养基的使用量，收获的病毒液的量就是消耗的培养基量，而转瓶生产工艺消耗的培养基的量是收获病毒液的2倍以上，且需要培养基量约5%的牛血清。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，具体讲涉及BHK-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用。
技术介绍
BHK-21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞，英文名称Baby Hamster Kidney cell简称 BHK-21或BHK21，该细胞系于1961年由Macpherson IA, Stoker MGP建系，源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾，1963年进行了单细胞克隆。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性生长，但后来经无数次传代驯化后可悬浮生长，该细胞广泛用于病毒增殖生产疫苗，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、乙脑疫苗等。因原始的BHK-21细胞为贴壁依赖性生长的，生产疫苗时用10升和15升转瓶进行贴壁培养细胞再制备疫苗。在生产口蹄疫疫苗时首先是用含牛血清细胞培养液将种子细胞多次传代扩大培养到一定数量，再将培养液倒掉，接种相应的口蹄疫病毒(如0 , Asia I等)后，换加不含新生牛血清的细胞维持液，待病毒增殖使细胞病变到一定程度后，收获全部维持液进行病毒浓缩，然后进行灭活、乳化等工艺制苗。现有工艺过程繁锁复杂周期长，劳动强度大，费工费力，原材料消耗大，而且质量不稳定，批间差大，制备的疫苗注射动物后副反应大。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供BHK-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用。包括有以下步骤1)细胞复苏;2)反应器培养及细胞放大培养；3)接种口蹄疫病毒种毒液及毒液收获。所述步骤1)的具体方法为a)取液氮冻存的BHK-21悬浮培养型细胞冻存管，每支冻存管的细胞数至少为1.0 X IO7 个，置于40°C水浴中快速溶解并接种入含质量百分含量20%牛血清的培养液40ml中，置于 370C 5% CO2 摇床培养 24 小时，110r/min ；b)将步骤a)培养得到的BHK-21细胞分成2瓶，每瓶用含质量百分含量5%牛血清的培养液补加至40ml，继续按a)的培养条件培养48小时后将全部细胞移到一个500ml悬浮培养瓶，补加培养液至200ml,置于370C 5% CO2摇床培养48小时，130 r/min ；c )将步骤b )培养后的BHK-21细胞用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。所述步骤2)的具体方法为A)将权利要求3中步骤e)得到的400ml细胞悬浮液接入到型号为BI0STATE0R B plus的反应器，补加培养液至2. 0L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min、温度36. 5°C、pH 7. 15，培养36小时后溶氧设定为50%，继续培养12小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；B)将步骤A)得到的细胞培养液补加培养液至4.0L,反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速95r/min、温度36. 5°C、pH 7. 20，溶氧70%,培养24小时，进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；C)将步骤B)中得到的细胞培养液全部移入到CLAV0RUS PLJ120的反应器，补加培养液至40L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和CO2，转速70r/min、温度36. 5°C、pH 设定下限7. 1，溶氧设定下限40%，培养48小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；D)向步骤C)的反应器CLAV0RUS PLJ120中补加培养液至80L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和CO2，转速lOOr/min、温度36. 5°C、pH设定下限7. 2，溶氧设定下限 40%,培养48小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；E)取60L步骤D)的细胞培养液至CLAV0RUS PLJ650的反应器并补加培养液至250L， 反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和CO2，转速lOOr/min、温度36. 5°C、pH设定下限7. 2，溶氧设定下限5096，培养48小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；同时， 向CLAV0RUS PLJ120的反应器补加培养液至80L，反应器参数设定同D)步骤，培养48小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；F)向反应器CLAV0RUS PLJ650补加培养液至500L，反应器参数与步骤E)中保持不变， 培养M小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，进入接毒工序；同时，取步骤E)中 CLAV0RUS PLJ120反应器中的60L细胞培养液至另一台CLAV0RUS PLJ650的反应器；G)按步骤F)用CLAV0RUS PLJ120反应器中的细胞培养液作为种子培养，用两台 CLAV0RUS PLJ650的反应器交替培养细胞进行接毒及毒液收获。所述步骤3)的具体方法为取口蹄疫病毒种毒液50L接种到权利要求4步骤F)的 CLAV0RUS PLJ650反应器，反应器pH设定7. 6，其它参数设定同步骤E)，从接毒培养的第10 小时起每小时台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，活细胞密度低于1. 0X106/ml或细胞活力< 20%后在无菌条件下取出所有细胞培养液冻融一次后取样，并用蔗糖密度梯度法测定口蹄疫病毒含量，口蹄疫病毒(146S)含量大于等于ΙΟΟΟμ g/ml时进行灭活、乳化工艺制备疫苗。所述培养液的制备方法为①、取50L包装的培养基干粉溶解于80 90%终体积的注射用水中，搅拌60分钟至澄清；②、在所述步骤①得到的溶液中加入50g氢氧化钠，搅拌60分钟；③、在所述步骤②得到的溶液中依次加入浓盐酸110ml，碳酸氢钠IOOg；④、将所述步骤③得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至7.2-7. 4 ；⑤、将所述步骤④得到的溶液过滤除菌后2—8 0C保存。本专利技术的有益效果为本专利技术提供的无血清悬浮培养BHK-21细胞生产口蹄疫灭活疫苗的工艺及细胞逐级放大的方法，使口蹄疫疫苗生产的周期缩短，产量增加，质量稳定，效益显著。本专利技术提供的技术从一支细胞冻存管中复苏算起到5L— 120L (1台)一650L (2 台)反应器逐级放大至细胞密度5XlO6Ail以上，20天可收获第一批病液550 L，以后每两天可培养收获一次，每次收获病液550L，全年按300天生产期计算可生产出约10万升病毒液，用15L转瓶培养细胞假如生产量达到每天接毒700瓶细胞，30天以后才能逐步每天收获毒液约700L，以后每天可收获700L，全年按300天生产期计算可生产出约20万升病毒液，但是悬浮培养的得到的口蹄疫病毒含量(146S)在接种0 和Aasi- I时均达1000 μ g/ ml以上，15L转瓶培养得到的有效病毒含量为280 μ g/ml左右，悬浮培养得到的146S是转瓶培养的3. 5倍以上，悬浮培养得到的病毒液数量虽然比转瓶培养的少，但可制备出转瓶培养1.5倍以上的疫苗。本专利技术提供的技术采用无血清生产工艺，消除了疫苗生产因使用牛血清而造成的缺陷，产品质量提高。使用血清的缺陷有牛血清中可能被支原体和病毒污染，存在生物安全的风险；血清的产地、批号不同，每批质量差异大，其成分不能保持一致；血清的使用使产品的标准化困难，其中的蛋白质在后期分离纯化工作中很难去除，动物副反应大；大规模生产中，血清来源越来越困难且价格昂贵，生产成本较高等。本专利技术提供的工艺减少人力和物力投入，降低了生产成本。从细胞培养开始到灭活工艺开本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．ＢＨＫ－２１细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用。
【技术特征摘要】
1.BHK-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于包括有以下步骤1)细胞复苏;2)反应器培养及细胞放大培养；3)接种口蹄疫病毒种毒液及毒液收获。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述步骤1)的具体方法为a)取液氮冻存的BHK-21悬浮培养型细胞的冻存管，每支冻存管的细胞数至少为 1. 0 X IO7个，置于40°C水浴中快速溶解并接种入含质量百分含量20%牛血清的培养液40ml 中，置于370C 5% CO2摇床培养24小时，110r/min ；b)将步骤a)培养得到的BHK-21细胞分成2瓶，每瓶用含质量百分含量5%牛血清的培养液补加至40ml，继续按a)的培养条件培养48小时后将全部细胞移到一个500ml悬浮培养瓶，补加培养液至200ml,于370C 5% CO2搅拌培养48小时，130 r/min ；c )将步骤b )培养后的BHK-21细胞用台盼蓝染色法进行细胞计数及活力检查。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述步骤2)的具体方法为A)将权利要求3中步骤e)得到的400ml细胞悬浮液接入到型号为BIOSTATEORB plus 的反应器，补加培养液至2. 0L，反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速80r/min、温度36. 5°C、pH 7. 15，培养36小时后溶氧设定为50%，继续培养12小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；B)将步骤A)得到的细胞培养液补加培养液至4.OL,反应器参数设定四路气体，分别为空气、氧气、氮气和CO2，转速95r/min、温度36. 5°C、pH 7. 20，溶氧70%,培养24小时，进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；C)将步骤B)中得到的细胞培养液全部移入到CLAV0RUS PLJ120的反应器，补加培养液至40L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和CO2，转速70r/min、温度36. 5°C、pH 设定下限7. 1，溶氧设定下限40%，培养48小时后进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查；D)向步骤C)的反应器CLAV0RUS PLJ120中补加培养液至80L，反应器参数设定三路气体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔自林，令世鑫，李明生，冯若飞，柏家林，沈武玲，王家敏，马桂兰，徐水林，冯玉萍，马忠仁，
申请(专利权)人：马忠仁，乔自林，令世鑫，李明生，冯若飞，冯玉萍，
类型：发明
国别省市：62
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