本发明专利技术提供了一种用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立。本发明专利技术的无血清冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)和血清替代组分。本发明专利技术解决了脂肪干细胞冻存质量不稳定以及血清中的有害因子对细胞影响的缺陷，用本发明专利技术无血清冻存液保存的脂肪干细胞具有成活率高、贴壁生长好、纯度高、分化能力强的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立。本专利技术冻存液克服了传统血清冻存液的缺陷，且经济有效，用本专利技术的冻存液建立的脂肪干细胞库，脂肪干细胞保存完好，具有很强的分化能力。
技术介绍
干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下， 它可以分化成多种功能细胞。胚胎、婴儿或成人都具有持久或终身自我更新能力的干细胞， 具有产生特异的细胞类型、形成人体组织和器官的潜能。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织，但在细胞分化调节和伦理上局限性限制了其临床应用。间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞可在体外培养扩增，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞以及肌肉细胞等多种组织细胞骨髓干细胞、脐带干细胞和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)近年来研究较多。骨髓干细胞由于不易取材、扩增较慢、对于体弱和老年患者不适用以及伦理等问题，给临床应用带来不便。脐带间充质干细胞与骨髓干细胞相比来源较广泛，免疫原性低，几乎无免疫排斥反应。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它与骨髓干细胞、脐带干细胞相比有很多优点，研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，生长均勻、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛、体内储备量大、适宜自体移植、 安全性能高，脂肪干细胞库的建立逐渐成为近年来新的研究热点之一。由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上， 达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此建立一种行之有效的冻存方法是必要的，通过检测人脂肪间充质干细胞在冻存复苏后的细胞周期，细胞表型和成脂的多向分化潜能来鉴定冻存方法的可靠性。目前冻存多采用血清进行冻存，血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其优势主要体现在(1)含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，充分支持细胞生长；(2)血清中的大量蛋白对细胞起到一定的保护作用；(3)为细胞的体外培养提供了细胞增殖所必需的生长因子和微量元素；(4)为贴壁依赖细胞提供贴壁因子。然而冻存液中使用动物血清也存在多种缺点，主要包括 (1)血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺；补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；(2)动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；(3)取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；(4)血清成本高，每500ml血清价格可高达3000-4000元；(5)血清的活体采集对动物有一定损害。目前还没有严格意义上的适用于脂肪干细胞和脂肪干细胞建库的无血清冻存液， 因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪干细胞的无血清冻存液。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效的可用于脂肪干细胞的无血清冻存液及其应用，避免含有血清的冻存液在临床使用中可能存在的风险。本专利技术的另一目的是提供一种新型高效的脂肪干细胞库及其建立方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种无血清冻存液，所述冻存液包括以下组分无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)和血清替代组分Knockout SerumR印lacement (KSR)，且所述冻存液不含血清。在另一优选例中，所述无血清冻存液按体积计，无血清培养基的含量为a，a选自 5% -15% (ν/ν)，DMSO 含量为 b，b 选自 8% -20% (ν/ν)，KSR 含量为 c，c 选自 70% -85% (ν/ν)，且 a+b+c ^ 100%o在另一优选例中，按体积计，a选自8-12% (ν/ν), b选自10_14% (ν/ν), c选自 75-80% (ν/ν) ο在另一优选例中，按体积计，a为10% (ν/ν)，b为12% (ν/ν)，c为78% (ν/ν)。在另一优选例中，所述无血清培养基选自DEME培养基、UltraMEM培养基。在另一优选例中，所述无血清培养基的为市售DEME培养基，并包含适量胰岛素、 转铁蛋白、青霉素和链霉素。在本专利技术的第二方面，提供了一种本专利技术第一方面所述无血清冻存液的用途，它被用于长期保存脂肪干细胞和/或建立脂肪干细胞库。在本专利技术的第三方面，提供了一种脂肪干细胞混合物，所述混合物包括以下组分脂肪干细胞，和本专利技术第一方面所述的无血清冻存液。在本专利技术的第四方面，提供了一种脂肪干细胞库，所述脂肪干细胞库含有本专利技术第三方面所述的脂肪干细胞混合物。在另一优选例中，所述脂肪干细胞和无血清冻存液的混合物用程序梯度降温后， 液氮保存。在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞具有诱导成脂的能力。在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞的存活率> 90%。在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞的存活率> 95%。在本专利技术的第五方面，提供了一种本专利技术第四方面所述脂肪干细胞库的用途，它被用于长期保存脂肪干细胞。在本专利技术的第六方面，提供了一种脂肪干细胞库的建立方法，包括步骤(i)对获得的含脂肪干细胞的脂肪组织材料进行洗涤，获得去除了血细胞的脂肪组织；(ii)对步骤⑴得到的脂肪组织进行消化，得到经消化的脂肪组织混合物；(iii)对上一步骤获得的经消化的脂肪组织混合物进行过滤，去除未消化的组织块，获得含脂肪干细胞的滤液；(iv)对上一步骤获得的滤液进行离心，弃去上层的脂肪，得到的沉淀为脂肪干细胞；(ν)对步骤(iv)得到的脂肪干细胞进行接种传代，得到脂肪间充质干细胞；(vi)消化上一步骤的脂肪间充质干细胞，得到分散的脂肪干细胞；(vii)用本专利技术第一方面所述的无血清冻存液与步骤(Vi)得到的脂肪干细胞混合，低温保存，得到脂肪干细胞库。在另一优选例中，步骤(ii)所述的消化为胶原酶消化，较佳地胶原酶I消化。在另一优选例中，步骤(Vi)所述的消化为胰蛋白酶消化。在另一优选例中，步骤(vii)包括用所述的无血清冻存液与步骤(vi)得到的脂肪干细胞混合，得到脂肪干细胞混合物，降温后液氮保存所述混合物，得到脂肪干细胞库在另一优选例中，步骤(vii)中使用程序降温法梯度降温，较佳地降温速率为-1 至-2 °C /min。在另一优选例中，步骤(vii)中当温度到达_25°C以下时，降温速率调至-5 至-IO0C /minO在另一优选例中，步骤(vii)中当温度达到-100°C时，将脂肪干细胞直接保存于液氮中。在本专利技术的第七方面，提供了一种自体移植组合物，所述自体移植组合物包括有效量的用本专利技术第一方面无血清冻存液保存后复苏的脂肪干细胞，或来源于本专利技术第四方面所述的脂肪干细胞库保存后复苏的脂肪干细胞，和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽，张炳强，张露亿，曹卫，
申请(专利权)人：臻景生物技术上海有限公司，臻景生物技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：
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