一种可维持细胞活性的组织冻存液制造技术

本发明专利技术提供了一种可维持细胞活性的组织冻存液。本发明专利技术的冻存液包括海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。用本发明专利技术冻存液保存的组织复苏后获得的脂肪干细胞具有贴壁生长好、纯度高、分化能力强的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种可维持细胞活性的组织冻存液。
技术介绍
低温冷冻保存是活体组织长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用，冻伤是低温保护最大的负反应，其原因可能为冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前组织的冻存主要有两种方法快速冻存法，即玻璃化法；慢速冻存法，即程序降温法。慢速冻存法较为常用。但是如果没有采取合适的冻存方法和合适的冷冻保护齐U，组织在冻存过程中容易被冻伤·超低温冷冻保存是在液氮(_196°C )中使保存的活细胞物质代谢和生长几乎完全停止的保存方法。在这样冷冻的条件下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，使细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变，细胞和组织不会丧失形态发生的潜能。但是，单纯的超低温保存会对细胞造成两方面的损伤。其一，在低温保存的过程中，细胞外部的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤；其二，随着温度的降低，细胞内的水分也会结冰，所形成的冰晶进一步破坏细胞膜和细胞器，这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。影响损伤程度的因素主要有冷冻速度、融冻速度及冷冻保护剂。冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般可分为渗透性与非渗透性两类。一般非渗透性保护剂是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤。常用的有蔗糖、聚乙烯卩比咯烧酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及轻乙基淀粉(hydroxyephylstarch, HES)等。而渗透性保护剂则主要为小分子物质,多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。主要有以下几种甘油、二甲基亚讽(DMSO)、丙_■醇、乙_■醇等。在前两种因素冷冻速度和融冻速度受目前工艺条件的限制，无法在短期内有较大改进的前提下，冷冻保护剂的正确选择及应用就成为了决定冻存效果的最关键因素。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。采用合适的方法冻存脂肪组织，并从中取得干细胞，可以为临床应用提供良好的条件，因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存液。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效的可用于脂肪组织的冻存液及脂肪组织的冻存方法。在本专利技术的第一方面，提供一种冻存液，包含以下组分海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为0.05 2mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为I: f 10。在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为O. Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为I:广5。·本专利技术的冻存液可以由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5 20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1-4 :13-18。在另一优选例中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为O. 5^10mol/l，较佳地为05 8mol/l。在另一优选例中，所述二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4 :1-4 :13_18 ;较佳地，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-1. 5 1-1. 5 :9-11。本专利技术的第二方面，提供第一方面所述的冻存液的用途，被用于长期保存脂肪组织和/或建立脂肪组织库。本专利技术的第三方面，提供一种脂肪组织混合物，所述混合物包括以下组分脂肪组织，和第一方面所述的冻存液。在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:0. 5-5，较佳地，为I: O. 8_2 ο在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:1-1. 5。本专利技术的第四方面，提供一种脂肪组织库，含有第三方面所述的脂肪组织混合物。本专利技术的第五方面，提供第四方面所述的脂肪组织库的用途，它被用于长期保存脂肪组织。本专利技术的第六方面，提供一种脂肪组织的冻存方法，包括步骤(i)对获得的含脂肪干细胞的脂肪组织材料进行洗涤，从而获得去除了表面杂细胞的脂肪组织；(ii)将步骤⑴得到的脂肪组织剪碎，得到O. 8^1. 5mm3的组织块；(iii)将步骤(ii)得到的组织块与第一方面所述的冻存液进行混合，得到脂肪组织混合物；(iv)将步骤(iii)得到的脂肪组织混合物降温后，于-70°C _200°C保存。在另一优选例中，所述步骤(iii)中所述组织块与所述冻存液的体积比为1:0. 8 2。在另一优选例中，所述步骤(iv)中将脂肪组织混合物放入程序降温盒，采用程序降温法梯度降温，_80°C冰箱或液氮内保存。在另一优选例中，所述步骤(iv)使用程序降温法梯度降温，较佳地降温速率为-I至-2 °C /min。在另一优选例中，所述步骤(iv)当温度到达_25°C以下时，降温速率调至-5至-10°C /min。在另一优选例中，所述步骤(iv)中当温度达到-40°C时，将装有脂肪组织混合物的程序降温盒直接保存于_80°C冰箱中。在另一优选例中，所述步骤(iv)中当温度达到-100°C时，将装有脂肪组织混合物的程序降温盒直接保存于液氮中 。本专利技术提供了一种适宜冻存组织，并维持组织内细胞活性的冻存液，采用渗透剂与非渗透剂结合的方法冻存组织，能够保证从复苏的组织中培养出适用于临床的干细胞。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图I为显微镜下观察培养第6、9、12天后、从新鲜脂肪组织中爬出的细胞的生长状态图。图2为显微镜下观察培养第6、9、12天后、从冻存复苏后的脂肪组织中爬出的细胞的生长状态图。图3为用流式细胞仪检测由复苏后的脂肪组织获得的干细胞传至第3代时表面标志抗原蛋白的鉴定结果，表明该脂肪干细胞的纯度很高。具体实施例方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，意外地发现，采用含有海藻糖、二甲基亚砜、KSR的冻存液冻存脂肪组织，复苏后可以获得的生长状况良好且纯度高的脂肪间充质干细胞。在此基础上，完成了本专利技术。脂肪组织和脂肪干细胞(ADSCs)如本文所用，术语“脂肪干细胞”指分离自脂肪组织的干细胞，具体地，脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。在本专利技术中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冻存液，其特征在于，所述冻存液包含以下组分：海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。

【技术特征摘要】
1.一种冻存液，其特征在于，所述冻存液包含以下组分海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。2.如权利要求I所述的冻存液，其特征在于，所述海藻糖的浓度为O.05^2mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为1:广10。3.如权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述海藻糖的浓度为O.Γ0. 5mol/l ;所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为1:广5。4.权利要求f3任一项所述冻存液的用途，其特征在于，它被用于长期保存脂肪组织和/或建立脂肪组织库。5.一种脂肪组织混合物，其特征在于，所述混合物包括以下组分 脂肪组织，和 权利要求Γ3任一项所述的冻存液。6.一种脂肪组织库，其特征在于，所述组织库含有权利要求5所述的脂肪组织混合物。7.权利要求6所述的脂肪组织库的用途，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，张丽，张露亿，赵光宇，李玉娟，
申请(专利权)人：臻景生物技术上海有限公司，臻景生物技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：