一种外周血单个核细胞的冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域。本发明专利技术提供一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V)β-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。本发明专利技术还提供一种外周血单个核细胞冻存方法，包括：（1）将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；（2）将所述外周血单个核细胞悬液与权利要求1-5中任一项所述的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1.1∶1的比例混匀，分装于细胞冻存管中；（3）将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地讲，本专利技术涉及。
技术介绍
外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell, PBMC),指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。PBMC是制备细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的种子细胞，CIK细胞因其同时表 达CD3和CD56而被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的PBMC。针对该问题目前常用的做法是，利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。为了将冻存过程中细胞的损伤降至最低，使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。因此需要采取缓慢冷冻、加入冷冻保护剂排除水分、在尽可能低的温度下保存细胞、快速复苏等方法来达到对细胞产生最低损伤的目的，其中冷冻保护剂的作用十分重要。常用的冷冻保护剂主要有甘油、二甲基亚砜(DMSO)等渗透性试剂，以及羟乙基淀粉(HES )、白蛋白和聚乙二醇(PEG)等非渗透性试剂，目前常用的是DMSO。现有技术中，细胞冻存复苏后的存活率通常在70%_90%之间。日本学者Makino S等采用5%DMS0、6%羟乙基淀粉、4%人血清白蛋白冻存自体外周血干细胞，冻存于_80°C，获得的复苏存活率为88. 4%±3. 6%，为目前已知报道中最高的存活率。不过叶韵斌等学者的报道显示，用此方法冻存的细胞回输给患者，有些患者出现了不适症状，原因可能是羟乙基淀粉(HES)为大分子物质，个别患者在使用含羟乙基淀粉的药品时，可能发生过敏性反应。因此，为提供足够量的PBMC，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术的目的是提高PBMC细胞冻存复苏后的存活率，同时避免将复苏后的PBMC细胞回输给患者时出现不良反应。为了实现上述专利技术目的，本专利技术技术方案如下一种外周血单个核细胞冻存液，包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V) ￠-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。以及，一种外周血单个核细胞冻存方法，包括以下步骤(I)将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；(2)将所述外周血单个核细胞悬液与本专利技术的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1. I I的比例混匀，分装于细胞冻存管中；(3)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于_80°C冷冻，然后转入液氮中冻存。本专利技术的PBMC冻存液使用了经美国FDA认证安全的P -葡聚糖作为冷冻保护剂，使冻存复苏后的PBMC的存活率达到91. 56%左右，且使用本专利技术的PBMC冻存液的单个核细胞复苏后经诱导培养得到的CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的比例与未冻存的PBMC相比十分接近，且两者的细胞生长曲线和增殖倍数没有明显差异，并且将该CIK细胞回输给患者后未引起不适症状。附图说明图I为使用本专利技术实施例I的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞的生长曲线图； 图2为使用本专利技术实施例I的冻存液冻存PBMC复苏后诱导得到CIK细胞与未冻存的PBMC诱导得到的CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的流式检测图，其中(a)为本专利技术实施例I的冻存液冻存的PBMC的检测结果，(b)为未冻存的PBMC的检测结果。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种能提高外周血单个核细胞冻存复苏后存活率，同时避免将复苏后诱导培养的细胞回输给患者时出现不良反应的外周血单个核细胞冻存液。该外周血单个核细胞冻存液包含10-12%(V/V)渗透性冷冻保护剂，10-14%(V/V) ￠-葡聚糖，8-10%(V/V)血清或血浆，64-72%(V/V)生理盐水。具体地，上述渗透性冷冻保护剂可渗透到细胞内，防止细胞在冻存的时候生成冰晶损伤细胞从而起到保护作用，本专利技术实施例中所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、DMS0、乙二醇和丙二醇中的一种或几种，优选的实施例中所述渗透性冷冻保护剂为DMS0，其优选浓度为10%(V/V)。其中，V/V为体积百分比。上述实施例中使用￠-葡聚糖作为非渗透性冷冻保护剂可降低回输给患者时的不良反应。葡聚糖是一种高分子葡萄糖聚合物，存在于某些微生物生长过程中分泌的粘液中，被美国FDA已认定是一种安全的物质，是目前最佳的血浆代用品之一，￠-葡聚糖是葡聚糖中最具生理活性的，广泛用于医药、食品、化妆品等行业。本专利技术优选实施例中所述^ -葡聚糖浓度为12%。上述生理盐水优选为注射用生理盐水，用分析纯氯化钠配制，优选浓度为68%。上述血清或血浆中的血清可为胎牛血清或小牛血清；血浆优选为自体血浆，自体血浆为抗凝外周血分离出细胞后得到的血浆，因与PBMC细胞来自同一受试者，因此称为自体血浆，自体血浆优选浓度为10%。本专利技术实施例的外周血单个核细胞冻存液使用了 ￠-葡聚糖作为非渗透性冷冻保护剂，使冻存复苏后的PBMC的存活率达到91. 56%左右，且使用本专利技术的PBMC冻存液的单个核细胞复苏后经诱导培养得到的CIK细胞中CD3+CD56+T细胞的比例与未冻存的PBMC相比十分接近，且两者的细胞生长曲线和增殖倍数没有明显差异，同时将该CIK细胞回输给患者后未引起不适症状，因此本专利技术的PBMC冻存液相对于现有技术有显著进步。本专利技术还提供一种外周血单个核细胞冻存方法，所述方法包括以下步骤( I)将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液；(2)将所述外周血单个核细胞悬液本专利技术的外周血单个核细胞冻存液按照0.9-1. I I的比例混匀，分装于细胞冻存管中；(3)将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于_80° C冷冻，然后转入液氮中冻存。优选地，步骤(I)得到的PBMC细胞悬液中细胞密度为2-10X IO7个/ml。悬浮PBMC细胞的培养液可以是本领域常用的PBMC培养液，如RPMI1640培养液。步骤(2)中将PBMC细胞悬液与PBMC冻存液优选以I : I的比例轻轻混合均匀，且使得分装于细胞冻存管中的细胞数量为1-5 X IO7个/支，通过调整外周血单个核细胞的密度，以达到最佳冻存效果。优选地，步骤(3)中将程序冻存盒于_80°C冷冻的时间为23-25小时，优选时间为24小时。优选地，在程序冻存盒中装有纯异丙醇，可实现每分钟1°C的降温。其中，纯异丙醇可以是分析纯的异丙醇或是工业中的纯异丙醇。本专利技术的实施例中将PBMC冻存后复苏，检测细胞存活率，诱导培养为CIK细胞，并检测所得的成熟CIK细胞中⑶3+⑶56+T细胞的百分比。同时将复苏并诱导得到的CIK细胞回输给患者并观察临床反应，以此检测PBMC冻存效果。本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞冻存液，包含体积百分比为10-12%的渗透性冷冻保护剂，10-14%的P -葡聚糖，8-10%的血清或血浆，64-72%的生理盐水。2.根据权利要求I所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述渗透性冷冻保护剂选自甘油、二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇中的一种或几种。3.根据权利要求I所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述生理盐水为注射用生理盐水。4.根据权利要求I所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述血清为胎牛血清或小牛血清。5.根据权利要求I所述的外周血单个核细胞冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。6.一种外周血单个核细胞冻存方法，包括以下步骤 (1)将外周血单个核细胞悬浮于细胞培养液中，获得外周血单个核细胞悬液； (2)将所述外周血单个核细胞悬液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘韬，
申请(专利权)人：深圳市博泰生物医疗机构管理有限公司，
类型：发明
国别省市：