本发明专利技术公开了一种用于CHO细胞表达促红素的无血清培养基以及CHO细胞中高效表达促红素的培养方法。所述无血清培养基中含有添加剂D-葡萄糖和正丁酸钠，还含有添加剂D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种。所述培养方法包括对活化后的种子细胞先采用含血清培养基进行含血清培养，然后采用所述的无血清培养基进行无血清培养。采用本发明专利技术的培养基和培养方法，能够获得高效、稳定表达的重组人促红细胞生成素蛋白，并且提高了促红细胞生成素的糖基化程度，即提高了EPO唾液酸的比重。采用本发明专利技术提供的培养方法每升培养液可获得高达1.0×107IU的重组人促红细胞生成素，表达稳定、培养方法简洁、适合大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物细胞培养领域，特别是涉及一种用于CHO细胞表达促红素的无血清培养基以及CHO细胞中高效表达促红素的培养方法。
技术介绍
促红细胞生成素(促红素，Erythropoietin, ΕΡ0)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，最早于1906年被发现。它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏)，由皮质管周围的间质细胞合成。在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，得率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定，亦无法大规模应用。应用DNA重组技术将促红细胞生成素的基因构建到中国仓鼠卵巢细胞中(CH0细胞)，形成高效表达重组人促红细胞生成素基因的CHO细胞，经过细胞扩增培养，更换表达培养基，收集培养上清，后经分离纯化可制备得到目的糖蛋白-ΕΡ0。在获得表达EPO的CHO细胞株的情况下，培养基的使用对EPO的表达量和糖基化稳定性具有重要影响。常规细胞培养基的EPO表达量约为4000IU/ ml，并且不同培养基的EPO表达量不稳定，所获得的EPO的糖基化程度也存在较大差异，不能很好的满足EPO工业化生产的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前的培养基不能满足CHO细胞中高效稳定表达EPO的问题，提供一种可用于提高EPO表达量和表达稳定性的无血清培养基，以及所述无血清培养基在CHO细胞高效表达促红素中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种采用所述无血清培养基，在CHO细胞中高效表达促红素的培养方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了一种无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，其特征在于所述添加剂包括正丁酸钠，还包括D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种。进一步的，所述添加剂还包括D-葡萄糖。更进一步的，本专利技术中优选的添加剂用量为D-半乳糖200_300mg/L，D-甘露糖 200-300mg/L, N-乙酰氨基葡萄糖 200_300mg/L，D-葡萄糖 l_3g/L，正丁酸钠 l-2mmol/L。所述基础培养基包括份数比1-3 7-9的DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基， 本专利技术中，优选的份数比为1 9。优选的，所述基础培养基由份数比1-3 7-9的DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基组成，更优选的份数比为1 9。本专利技术还公开了一种上述培养基在CHO细胞高效表达促红素中的应用。本专利技术还公开了一种CHO细胞中高效表达促红素的培养方法，所述培养方法包括对活化后的种子细胞先采用含血清培养基进行含血清培养，然后采用上述的无血清培养基进行无血清培养。所述含血清培养基为含有质量份数5% -10%牛血清的DMEM培养基，优选的牛血清含量10%。所述含血清培养基还包括0. 5-1 μ mol/L的MTX。所述含血清培养和无血清培养的条件为，溶解氧浓度30% -80%, pH值7. 0-7. 4， 温度35°C _38°C。需要指出的是，本专利技术优选的实施方案中，为了保证培养效果，优选的细胞接种密度大于3X 105cells/mL。由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果在于采用本专利技术的培养基和培养方法，使得CHO-EPO细胞能够高效、稳定表达重组人促红细胞生成素蛋白，提高细胞表达与目标蛋白的糖基化程度，即提高了唾液酸EPO的比重。采用本专利技术提供的培养方法每升培养液可获得高达LOXIO7IU的重组人促红细胞生成素，表达稳定、培养方法简洁、适合大规模生产。附图说明图1是本专利技术实施例中细胞培养流程图；图2是本专利技术实施例中不同浓度的正丁酸钠对EPO表达量的影响结果；图3是本专利技术实施例中不同浓度MTX对EPO表达量影响结果；图4是本专利技术实施例中糖基化试剂对高唾液酸EPO的比重的影响结果；图5是本专利技术实施例中无血清培养天数及对应的每天的EPO表达量；图6是本专利技术实施例中无血清培养天数及对应的每天消耗糖量。具体实施例方式本专利技术提供了一种新的可用于提高EPO表达量和表达稳定性的无血清培养基， 所述无血清培养基包括基础培养基和添加剂。所述添加剂包括正丁酸钠，还包括D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种，进一步的还包括D型葡萄糖(D-葡萄糖)。所述基础培养基包括一定份数比例的DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基，本专利技术中，优选基础培养基由DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基组成。所述一定份数比例为 1-3 7-9，优选为1 9。进一步的，所述添加剂的用量为D-半乳糖200-300mg/L，D-甘露糖200-300mg/L，N-乙酰氨基葡萄糖200_300mg/L，D-葡萄糖l_3g/L，正丁酸钠l-2mmol/ L0本专利技术还提供了上述培养基在CHO细胞高效表达促红素中的应用以及培养方法， 包括对活化后的种子细胞先采用含血清培养基进行培养，然后采用上述的培养基进行无血清培养。具体培养流程包括种子细胞活化扩增培养，然后接种到生物反应器分别进行含血清培养和无血清培养，最后收获细胞培养液(图1)。进一步的为了获得EPO产品，还需要对细胞培养液进行后续的分离、纯化目标蛋白等常规操作。其中，(1)种子细胞活化扩增培养细胞复苏，扩增培养，在添加0. 5-1 μ mol/L MTX和10%牛血清的DMEM培养基中进行； 然后用胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，用于接种生物反应器。( 含血清培养在添加 0. 5-1 μ mol/L MTX和10%牛血清的DMEM培养基中进行，控制培养条件为溶氧30% -80%, pH 值 7.0-7.4，温度；351 _38°C，优选为 36. 8 士0.2 °C。(3)无血清培养用添加 250mg/L D-半乳糖、250mg/L D-甘露糖、250mg/L N-乙酰氨基葡萄糖、l_3g/L葡萄糖和l-2mmol/L4正丁酸钠的无血清培养基继续培养细胞，控制培养条件为溶氧30% -80%, pH值7. 0-7. 4， 温度35 °C -38°C，优选为36. 8 士 0. 2°C。所述无血清培养基即上述本专利技术所述的DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基组合而成的培养基。所述种子细胞为构建了促红细胞生成素基因的EPO表达的CHO细胞，可以通过商业途径获得，一般通过商业途径获得的EPO表达CHO 细胞经过筛选和保存处理，需要经过活化等步骤才能用于后续操作。下面通过具体实施例并结合附图对本专利技术作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本专利技术进行进一步的说明，不应理解为对本专利技术的限制。实施例1按照培养流程，将种子细胞活化扩增培养，然后用胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，接种，在不含MTX的10 %牛血清DMEM培养基中进行含血清培养后，将细胞分别于含Ommol/L正丁酸钠、0. 5mmol/L正丁酸钠、1. Ommol/L正丁酸钠和2. Ommol/L无血清培养基中培养，所述无血清培养基包括份数比1 9的DMEM培养基和CHO-S-SFM II培养基。 36. 8士2°C培养48小时后收集上清，分别测定培养上清的EPO表达量。结果显示，l-2mmol/ L的正丁酸钠，既能稳定单位细胞EPO的表达量，对细胞的生长也没有明显的影响。结果见图2。实施例2按照培养流程，将种子细胞活化扩增培养，然后用胰蛋白酶消化细本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，其特征在于：所述添加剂包括正丁酸钠，还包括Ｄ－半乳糖、Ｄ－甘露糖、Ｎ－乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴园园，盛光阳，张涤平，吴建祥，张自强，曲和之，黄俊龙，刘乐连，
申请(专利权)人：深圳赛保尔生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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