本发明专利技术涉及一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，利用皮肤成纤维细胞外基质诱导和机械分离与酶消化相结合的方法，启动了ORSC的原代培养，并利用不同培养液，成功建立了山羊毛囊外根鞘细胞系。利用本发明专利技术构建的山羊毛囊外根鞘细胞系已稳定传至第40代以上，且生长分裂状态良好。本发明专利技术不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高山羊毛产量和羊绒品质的育种改良奠定基础；还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于细胞生物学领域。
技术介绍
毛囊(Hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官， 是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生的能力。毛囊在形成与分化过程中至少涉及到20余种不同的细胞群，主要由毛乳头、毛母质、内根鞘和外根鞘等细胞组成。其中，外根鞘细胞(Outer root sheath cell, ORSC)作为一种重要的毛囊上皮细胞，因具有高度增生的潜能，在毛发再生、伤口愈合、初级毛囊和次级毛囊分化等生理过程中均起着重要作用，因而越来越受到高度关注。自Wetering等(1981)利用经钴源照射后的牛晶状体包膜囊作为支持物，成功诱导人毛囊外根鞘细胞迁移出游离毛囊以来，已有不少学者针对ORSC体外培养体系与技术进行过改进。其中，Well等(1982)将分离的毛囊直接接种到塑料培养皿中，在控制培养液PH不高于7. 2的条件下，贴壁毛囊周围便可游离出外根鞘细胞，但该方法获得的外根鞘细胞产量低且再生能力差，不便于进行进一步的研究与大量的应用。迄今，已有多种细胞分离技术和细胞培养方法运用于ORSC的体外培养，其中，较为常用的培养方法有两种 一种是将分离的毛囊经胰蛋白酶消化处理后，用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，然后接种于经丝裂霉素处理的3T3细胞滋养层上， 37°C、5%C02 条件下进行原代培养(Rheinwald K. et al. , 1985; LimatA. et al. , 1986; Sabolinski M. L. ea al. , 1996 ； Naughton G. et al. , 1997 ； McElwee K. J. et al., 2003;唐建兵等，2005)；另一种则是利用胶原包埋法进行外根鞘细胞的培养分离带有外根鞘部位的毛囊，37°C下进行胰酶消化处理，随后将毛囊转移至I型和IV型胶原包被的塑料培养皿中，加入含有10%FBS的DMEM培养液进行培养，待毛囊牢固贴附于培养皿底壁后， 换用无血清的DMEM培养液进行培养(Detmar M. et al. , 1993; Sotaro K. et al., 1994; Limat A. et al. , 1996 ； Schirren C. G. et al. , 1997 ； Oshima H. et al. , 2001 ； Juergen S. et al., 2008;伍津津等，2008)。以上两种方法虽均能获得毛囊外根鞘细胞， 但仍存在少量非外根鞘细胞，且细胞传至圹10代后出现凋亡现象，以致无法继续进行传代培养。上述外根鞘细胞的培养多以人的毛囊为细胞的组织来源。对于其它哺乳动物ORSC 的培养，主要借鉴人毛发外根鞘细胞培养方法。研究表明，将分离得到的小鼠触须毛囊接种于含有表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)及10%FBS的RPMI1640培养基中，且细胞培养板预先用经丝裂霉素C处理的表皮细胞滋养层覆盖，可成功分离得到纯一的ORSC 并稳定生长至8 10代(Jahoda CA. et al. , 2001;钟白玉等，1999 ；高强国等，2004)。亦有学者在上述分离培养方法的基础上加以改进，成功分离培养了大鼠、牛、羊驼、猪、兔等动物的毛外根鞘细胞及其它毛囊细胞(Tsuyoshi H. et al. , 2001; Miyashita H. et al.,2004; Christiano AM. et al. , 2004;陈大元等，1999 ；魏泓等，2004 ；李键等，2007)。尽管许多学者在动物毛囊细胞培养方面进行了大量的研究，但有关山羊毛囊细胞体外培养研究，尤其是外根鞘细胞系建立等方面的报道相对较少，可应用于动物毛囊研究方面的细胞株与细胞系亦不多。因此，有必要建立体外培养毛囊外根鞘细胞系和完善培养方法，为进一步开展毛囊细胞的生长、发育、分化等研究建立离体细胞模型。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是建立与完善山羊体外培养毛囊外根鞘细胞系(Outer root sheath cell line)的构建方法，不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高山羊毛产量和羊绒品质的育种改良奠定基础；还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。技术方案本专利技术所述的构建外根鞘细胞系过程中，首先利用中性蛋白酶(Dispase)分离毛囊的上皮部分和真皮部分，以利于纯化培养毛囊外根鞘细胞。为了促进细胞由毛外根鞘部迁移与贴壁生长，接种游离毛囊用的细胞培养板前期已进行皮肤成纤维细胞外基质的覆盖处理。然后，采用机械分离与酶消化相结合的方法，分离完整毛囊及纯一的ORSC 即先利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，再对毛囊进行酶(胰蛋白酶)消化处理，随即将毛囊培养于含有表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、类胰岛素生长因子-I (Insulin-like growth factor-I, IGF—I)、氧化可的丰公(hydrocortisone)禾口 10%FBS 的 DMEM/F12培养液中，置5%C02浓度的37°C饱和湿度培养箱中进行培养。当培养板中的毛囊迁移出大量细胞时(约4飞天)，换为含有EGF、IGF-I和氢化可的松的无血清角质细胞培养液(Keratinocyte-krum Free Medium, K-SFM)中启动原代培养。待原代外根鞘细胞生长至汇合时，进行传代，将稳定生长至纩10代的细胞更换含EGF、IGF-I、氢化可的松和2%FBS 的DMEM/F12培养液中培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代培养。采用该方法本细胞系已经稳定传至40代以上，其生长分裂状态良好。—种，包括以下步骤(1)活体采集广3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cmX0. 5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清 DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；(2)预先采用组织块贴壁方法，分离并培养山羊皮肤成纤维细胞于6孔细胞培养板中， 待细胞生长至会合时，除去所述无血清培养液，按每孔3mL量加入含1% Triton X-100的无菌超纯水，37°C孵育30min后，去除Triton X_100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4°C下(3)将皮肤组织样经无菌化处理剪成组织悬液，利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，采用组织培养与消化培养相结合的方法，将游离毛囊进行胰蛋白酶消化处理后接种于步骤(2)制备的6孔培养板中，每孔加入3mL量含lOng/mL EGFU0ng/mL IGF-I, 0.4 μ g/mL氢化可的松和10%FBS的DMEM/F12完全培养液，在37°C，5%C02浓度饱和湿度条件下进行培养；约4一5天待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为等量含lOng/mL IGF-I本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：ａ、活体采集１～３日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤０．５ｃｍ×０．５ｃｍ大小的含完整毛囊的皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液，于冰盒中带回实验室，在１２ｈ内进行分离培养；ｂ、预先采用组织块贴壁方法，分离并培养山羊皮肤成纤维细胞于６孔细胞培养板中，待细胞生长至会合时，除去所述无血清培养液，按每孔３ｍＬ量加入含１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液，３７℃孵育３０ｍｉｎ后，去除Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于４℃下备用；ｃ、将皮肤组织样经无菌化处理剪成组织悬液，利用Ｄｉｓｐａｓｅ酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，采用组织培养与消化培养相结合的方法，将游离毛囊进行胰蛋白酶消化处理后接种于上述６孔细胞培养板中，每孔加入３ｍＬ量含１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－Ｉ、０．４μｇ／ｍＬ氢化可的松和１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培养液，在３７℃，５％ＣＯ２浓度饱和湿度条件下进行培养；约４—５天待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为等量含１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－Ｉ、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．４μｇ／ｍＬ 氢化可的松的无血清角质细胞培养液，在３７℃，５％ＣＯ２浓度饱和湿度培养箱中启动原代培养；待游离出的毛囊外根鞘细胞生长成单层后，消化移入培养瓶中，按照每瓶１０ｍＬ量加入含１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－Ｉ、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．４μｇ／ｍＬ 氢化可的松的无血清角质细胞培养液进行培养，每２～３天更换一次工作培养液；ｄ、当毛囊外根鞘细胞生长至会合状态后，进行传代；待ＯＲＳＣ稳定生长至８～１０代时，更换成１０ｍＬ含１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－Ｉ、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．４μｇ／ｍＬ 氢化可的松和２％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２维持培养液进行培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代；ｅ、选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含１０％ ＤＭＳＯ和３０％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于４℃１ｈ、－２０℃１ｈ、－７０℃１２ｈ，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用４０℃温水快速解冻细胞，按５×１０５个／ｍＬ的细胞密度接种于培养瓶。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，崔志峰，胡艳霞，曾勇庆，陈维云，周芬娜，董忠典，张娇，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37
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