一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系及其建立方法本发明专利技术针对HSP70在PD疾病发生发展中的作用尚未完全清楚，需要多种研究方法进一步明确的情况，通过构建针对HSP70的RNA干扰慢病毒表达质粒载体，建立干扰质粒稳定转染的SH‑SY5Y细胞系。本发明专利技术采用的技术方法:设计并合成多个针对hsp70基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体，通过与包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平，筛选出有效干扰质粒；通过慢病毒感染法将该有效干扰质粒稳定转染至SH‑SY5Y细胞系，通过携带的GFP荧光筛选获得稳转细胞系，荧光定量PCR检测验证。该细胞系与亲本细胞系相比具有类似的生长曲线。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因及细胞
，本专利技术涉及一种HSP70 RNA干扰稳定细胞系及其建立方法。
技术介绍
帕金森病（Parkinson DisSH-SY5Yse, PD）是一种椎体外系进行性神经退化性疾病，病理学主要表现为黑质多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能神经纤维的数量显著下降。大量动物实验证明氧化应激损伤对PD的发生起重要作用。免疫反应在PD发生中的作用也受到关注，PD中的免疫反应是由沉积的α突触核蛋白激活星形胶质细胞来启动的，分泌的大量细胞因子、化学因子激活小胶质细胞，活化的小胶质细胞会进一步释放大量神经炎症介质、趋化因子，最终使得神经元损伤；同时活化的星形胶质细胞激活氧化应激作用最终导致神经元死亡。α-突触核蛋白基因过表达或突变可引起α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病。研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，热休克蛋白70(hsp70)作为分子伴侣家族中的一员,是一种重要的应激蛋白,能与错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成，并且还有助于错误折叠蛋白的降解，因此将其用于PD的发病机制与疾病治疗方面的研究，已有研究表明HSP70能减轻帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白毒性的作用。RNA干扰技术可特异性剔除或关闭特定基因的表达，已被用于广泛探索基因功能的研究领域。SH-SY5Y 细胞为人的神经母细胞瘤细胞，常用于PD发病机制的研究。目前PD发病机制的研究中，HSP70的作用尚不完全清楚，尚没有采用HSP70 RNA干扰技术的研究方法。
技术实现思路
本专利技术针对HSP70在PD疾病发生发展中的作用尚未完全清楚，需要多种研究方法进一步明确的情况，通过构建针对HSP70的RNA干扰慢病毒表达质粒载体,建立干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y细胞系。本专利技术采用的技术方法:设计并合成多个针对hsp70基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体，通过与包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平,筛选出有效干扰质粒;通过慢病毒感染法将该有效干扰质粒稳定转染至SH-SY5Y细胞系,通过携带的GFP荧光筛选获得稳转细胞系,荧光定量PCR检测验证。附图说明图1.为本专利技术实施例1中不同HSP70 RNA干扰序列下的细胞HSP70表达水平比较。其中横坐标为不同样品（sample），纵坐标为hsp70 mRNA相对表达水平（relative amout）。图2.为本专利技术实施例2中所采用的荧光定量PCR标准曲线。图3.为本专利技术实施例3中采用含HSP70 RNA干扰序列的慢病感染SH-SY5Y细胞荧光检测图。图4：慢病毒干扰重组质粒的酶切电泳图。图5：SH-SY5Y-hsp70细胞系稳定性分析。其中第1代和第30代分别指第1代和第30代SH-SY5Y-hsp70细胞系，明场是指明场下细胞照片，荧光场是指荧光场下细胞照片。图6：SH-SY5Y-hsp70细胞系与野生型SH-SY5Y细胞系生长曲线比较。其中横坐标为细胞生长时间（培养时间），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。图7：不同浓度DMSO对细胞活性的影响；其中横坐标为不同浓度DMSO（DMSO: 浓度），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。具体实施方式药品与试剂：各种限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自MN公司；转染试剂M40为实验室自主制备；DMEM培养基，抗生素，胰酶，D-PBS购自hyclone公司，胎牛血清购自GIBCO公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂。仪器：倒置荧光显微镜Ti，尼康公司。本专利技术的高效表达细胞模型可稳定表达干扰序列和绿色荧光蛋白，因此可以在荧光显微镜下直接观察。实施案例1 HSP70干扰序列的设计和筛选根据GenBank公布的HSP70基因HSPA1A（序列号：NM_005345.5）设计4条干扰序列见表1：表1.HSP70 RNA干扰序列序列名称序列信息 起始位置 S1ACCATTGAGGAGGTAGATT 2101 S2CATGACGAAAGACAACAAT 1539 S3TGGAGGAGTTCAAGAGAAA 920 S4TGACCAAGATGAAGGAGAT 566 将4种干扰序列分别克隆至慢病毒质粒载体中，重组表达质粒酶切电泳图见图4。采用瞬时转染的方法转染293T细胞。293T细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱内培养。转染前1天消化293T细胞，计数，将细胞接种至35mm培养皿内，每个培养皿接种6×105个细胞；次日用不含FBS的DMEM培养基分别配制钙转试剂和RNA干扰质粒，每84μl培养基内加入16μl钙转试剂，每100μl培养基内加入4μg质粒，分别混匀后将钙转溶液和质粒溶液轻轻混匀，室温静置10分钟，逐滴加入培养皿内，在37℃，5%CO2培养箱内培养24h，更换新鲜的含10% FBS的高糖DMEM培养基继续培养48h，收集细胞，提取细胞RNA。分别取1μg RNA反转录cDNA，采用荧光定量PCR法检测HSP70的表达水平，以beta-actin作为内参，荧光定量PCR所采用的引物探针序列见表2：表2.hsp70和beta-actin引物探针设计引物名称序列F-hsp70TAACCCCATCATCAGCGGACR-hsp70GAAGCTCCAAAACAAAAACAGCAP-hsp70Fam-TTCGGGGCTCAGGGTCCCA-BHQ1F-actinbTATCGCCGCGCTCGTCGTCR-actinbTCTTGCTCTGGGCCTCGTCP-actinbJoe-CAACGGCTCCGGCATGTGCAAG-BHQ1采用2-△△CT相对定量方法计算不同RNA干扰序列样品的HSP70表达水平。筛选出表达水平最低的RNA干扰序列。检测结果（见图1）表明S3序列的HSP70表达水平最低，说明S3序列的RNA干扰效果最好，选该序列作为建立稳定细胞系的干扰序列。本专利技术中使用慢病毒表达载体prrl-CMV作为GFP的表达载体，制备方法使用现有的公认技术，其中GFP的CDNA序列为SEQ ID NO.1所示。实施案例2 HSP70干扰慢病毒的包装制备在真核细胞转染和基因治疗领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。因此本专利技术使用慢病毒包装、感染的方法获得最终的稳定转染细胞系。目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因（如：envelope-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH‑SY5Y，其特征在于采用TGGAGGAGTTCAAGAGAAA干扰序列构建。
【技术特征摘要】
1.一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于采用TGGAGGAGTTCAAGAGAAA干扰序列构建。2.权利要求1所述的干扰序列的HSP70表达抑制率可达到99%以上。3. 权利要求1所述的干扰序列后面连接GFP基因，可通过检测GFP荧光来检测慢病毒感染效果。4. 权利要求2所述的HSP70表达水平是通过荧光定量PCR相对定量方法检测的。5. 根据权利要求1所述的用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于：所述GFP基因序列为SEQ ID NO:1。6. 根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明，尹衍新，蒋韵，毛玉婷，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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