用于自动生成遗传修饰的T细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品，b)通过离心制备细胞样品，c)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，d)利用调节剂活化富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，f)遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞在培养室中扩增，g)洗涤培养的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞，其特征在于所有步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及修饰的T细胞的自动生成。
技术介绍
目前临床产生基因修饰的T细胞是一个复杂的过程，其一般开始于获得患者的外周血单核细胞(PBMC)。现有方案以白细胞分离步骤为特征，其为了增加的细胞产率而以最初的更麻烦的处理为代价(与较小量的抽血相反)。PBMC常常在用病毒或非病毒载体基因修饰之前进行T细胞富集和激活。然后扩增修饰的T细胞以达到治疗所需的细胞数量，在这之后，细胞在回输前进行最终配制和/或冷冻保存。必须对细胞产物进行多项质量控制检验，并必须满足所有发布的标准和优良制造规范(GMP)指南。迄今为止，利用基因修饰的T细胞的过继细胞转移(ACT)主要由通过现有的装置和基础设施开发了其用于小规模临床试验的生产方法的研究人员实施。这样的个性化治疗是复杂的：该细胞生产方法是费力的，因为它包含许多(开放的)操作步骤(例如，密度梯度细胞加工、基因修饰、洗涤、喂养等等)，其需要来自经历深度训练的专业熟练的操作人员的介入。失败率可能由于生产这些复杂的产物对于清洁室人员的高技能和时间要求而是高的。此外，具有清洁室的专用基础设施和所有必需的仪器必须到位、合格和是功能性的以确保净化和无菌的密闭。这些要求将此类临床制造限制于全世界的数量有限的机构。这反过来限制了运行的次数，和因此限制了可以在任何给定时间服务的患者数目。这种不利的商业分配模式阻碍了投资并因此阻碍了广泛发展对于需要的患者的有希望的疗法(Kaiser AD，Cancer Gene Therapy(2015)，1-7)。因此，在本领域中需要用于生成临床使用的基因修饰的T细胞的方法，其更稳健且不依赖于操作者的技能。
技术实现思路
通常，难以使生物学过程自动化，特别是在必须将多个过程相结合以产生复杂的产品例如基因修饰的T细胞的时候。因此，令人惊讶地发现，在适合于在封闭的符合GMP的环境(封闭的和无菌的细胞培养系统)中的细胞处理的装置中实施产生遗传修饰的T细胞的自动化过程是稳健的并且产生与非自动化过程相比相同的或甚至更高量的适合于临床应用的遗传修饰T细胞。本专利技术公开了如何获得更高的转导效率和稳健的临床相关数量的基因修饰T细胞的生产，这是由于自动化固有的较少操作和细胞的更“柔和”的操作。在封闭的符合GMP的系统中可以用例如CliniMACS和相关的管道组(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)进行细胞处理。所述CliniMACS提供用于细胞处理应用的灵活的平台，从而能够实现不同细胞类型的磁性分离以及细胞处理方案。样品处理系统的细节也公开于WO2009/072003中。本专利技术的方法包括自动化的细胞制备，T细胞、T细胞亚群或T细胞祖细胞的选择(分离)，所述细胞的活化，所述细胞的扩增，所述细胞的转导，和所述细胞的配制(洗涤)，例如，用于随后临床使用。附图说明图1：来自代表性的自动化T细胞富集的结果。图2：自动化T细胞活化。图3：允许基因修饰T细胞的自动化生产的软件架构的示意图。图4A，B，C：基因工程化T细胞的生产过程中培养物振摇的影响。图5：细胞培养物的密度与施加到培养物的振摇类型的影响之间的关系。图6：自动化生产运行的在线监控。图7A，B：手动的相对于自动化的条件的转导效率。图8：自动化T细胞生产的稳健性。图9A，B：在第0天使用振摇条件的自动化生产。图10：在自动化生产过程中细胞培养物的组成。具体实施方式用于生产基因修饰的T细胞的现有技术包括使用大量的装置来执行生产基因修饰的T细胞的小步骤。许多步骤需要人工干预，因而增加了错误的风险。这里，使用单次使用的封闭的和无菌的管道组和编程的软件在单个装置中执行所有步骤，例如，使用CliniMACS令人惊异的是，本专利技术的方法相比于手动过程导致所生产的T细胞的更高转导效率和该基因修饰T细胞的更高的转基因表达(图8)。而且可以在不到2周内稳健地产生大量具有高存活力的T细胞(图8和6)。与本文公开的本专利技术方法相关的这些优点依赖于整个过程中高度保持的环境(温度和气体)，因为细胞并不需要从培养箱移出例如用于取样(否则其将导致培养物温度的强降低)，并且由于细胞在管道组中温和的处理和操作和不存在手动移液和/或使用产生难以控制强度和标准化的剪切力并且对细胞和处理有害的注射器。在一个方面，本专利技术提供了一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的自动化过程(方法)，其包括以下步骤：a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品；b)通过离心制备该细胞样品；c)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；d)使用调节剂活化富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；f)在培养室中扩增该遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；g)洗涤培养的T细胞，其特征在于，所有的步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的磁性分离可通过使用对于该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞表面上的细胞表面标志物特异性的抗原结合分子进行，例如标志物CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD95、CD127、CD137、α/βTCR、γ/δTCR、CCR7、PD-1或Lag3。所述调节剂可以选自于激动性抗体、细胞因子、重组共刺激分子和小的药物抑制剂。优选地，所述调节剂是与珠或纳米结构偶联的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段。更优选地，所述调节剂是纳米基质，该纳米基质包含：a)活动的聚合物链的基质，以及b)与所述活动聚合物链的基质连接的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段，其中该纳米基质的尺寸是1至500纳米。该抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段可以连接到相同的或不同的活动聚合物链的基质。如果抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段连接到不同的活动聚合物链的基质，微调该纳米基质以刺激T细胞是可能的。该纳米基质可以是可生物降解的。此外，如在WO2014/048920A1中所公开的所述小的纳米基质的无菌过滤是可能的，其是在符合严格的GMP标准的条件下，即在封闭的和无菌的细胞培养系统中，长期的T细胞体外增殖中的一个重要特征。可以通过转导、转染或电穿孔进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述遗传修饰。优选地，用慢病毒、γ-逆转录病毒、α-逆转录病毒或腺病毒进行转导或用核酸(DNA、mRNA、miRNA、反义核苷酸抑制剂(antagomirs)、ODNs)、蛋白质、位点特异性核酸酶(锌指核酸酶、TALENs、CRISP/R)、自复制RNA病毒(例如马脑病病毒)或整合缺陷型慢病毒载体进行电穿孔或转染。更优选地，可通过用慢病毒载体转导所述细胞进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述遗传修饰。可通过向所述培养室添加用于细胞培养增殖的适合的细胞培养基，如TexMACS GMP培养基(Miltenyi Biotec GmbH)，来进行遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述扩增。可以通过振摇条件进行T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的所述活化、遗传修饰和/或所述扩增。优选地，在T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品；b)通过离心制备该细胞样品；c)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；d)使用调节剂活化该富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；f)在培养室中扩增该遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；g)洗涤该培养的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；其特征在于，所有步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.24 US 61/983,5431.一种用于产生遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供包含T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的细胞样品；b)通过离心制备该细胞样品；c)磁性分离该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；d)使用调节剂活化该富集的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；e)遗传修饰该T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；f)在培养室中扩增该遗传修饰的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；g)洗涤该培养的T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞；其特征在于，所有步骤在封闭的和无菌的细胞培养系统中进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节剂选自于激动性抗体、细胞因子、重组共刺激分子和小的药物抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述调节剂是与珠或纳米结构偶联的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述纳米结构是纳米基质，该纳米基质包含：a)活动的聚合物链的基质，以及b)连接到所述活动的聚合物链的基质的抗-CD3和抗-CD28抗体或其片段，其中该纳米基质的尺寸是1至500纳米。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过用慢病毒、γ-逆转录病毒、α-逆转录病毒或腺病毒转导所述细胞，或通过电穿孔或通过核酸、蛋白质、位点特异性核酸酶、自复制RNA病毒或整合缺陷型慢病毒载体的转染进行所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的遗传修饰。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中通过用慢病毒载体转导所述细胞进行所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的遗传修饰。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述T细胞、T细胞亚群和/或T细胞祖细胞的磁性分离是通过使用对于T细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·凯泽，M·阿森马赫尔，I·约翰斯顿，
申请(专利权)人：美天旎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE