本发明专利技术涉及分离的启动子和合成构建体的应用，其用于在选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种，尤其是选自红冬孢属、红酵母属、Pseudozyma、黑粉菌属或掷孢酵母属的物种中有效产生遗传学修饰的细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】来自红冬孢属和红酵母属的多核苷酸序列及其用途 相关申请的交叉引用 本申请涉及并要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请系列号61/782, 832 的权益。该申请通过引用并入本文。 序列提交 本申请和电子格式的序列表一起提交。所述序列表名为 2577230PCTSequencListing.txt，创建于2014年2月18日且大小为39kb。该序列表的电 子格式中的信息是本申请的一部分并且通过引用以其整体并入本文。 专利技术背景 本专利技术涉及真菌生物技术的领域，更具体涉及在柄锈菌（Pucciniomycotina)亚 门和黑粉菌（Ustilaginomycotina)亚门物种中的强基因表达系统。 本文中用于说明专利技术背景的出版物和其它材料，以及尤其是针对实施提供额外细 节的例子，通过引用并入，并且出于方便在下文通过作者和日期引用并在所附参考书目中 以作者字母顺序列出。 柄锈菌是担子菌（Basidiomycota)门中的真菌亚门（Kirk et al.，2008)。其 包括许多具有重要工业应用的物种。例如，红冬孢属（Rhodosporidium)和锁掷酵母 属（Sporidiobolus)的许多物种，如类酵母红冬抱（Rhodosporidium toruloides)(也 已知为纤细红酵母（Rhodotorula gracilis)、Rhodosporidium glutinis、胶粘红酵 母（Rhodotorula glutinis)、小石川氏圆酵母（Torula koishikawensis)和 Torula rubescens)和赭色掷孢酵母（Sporobolomyces salmonicolor)，是能够高密度发酵的富油 单细胞酵母（Hu et al.，2009;Meng et al.，2009)。这些物种具有作为产生长链烃类，例 如三酰基甘油（TAG，或脂肪）、脂肪酸酯（生物柴油）、脂肪族醇类、醇类、内酯类、萜类化合 物和维生素的宿主的极大潜能（Wu et al.，2010a ;Wu et al.，2010b ;Zhao et al.，2010a ; Zhao et al.，2010b)。在另一实例中，黑粉菌亚门中的物种，尤其是黑粉菌属（Ustilago) 和Pseudozyma属，已知产生糖脂类，其可以作为表面活性剂或杀真菌剂（Hewald et al.， 2005 ;Teichmann et al. ，2010)〇 能够驱动强基因表达（组成型或诱导型）的启动子，对于微生物的生物技术应 用开发是关键的。WO 2012/169969,以其整体通过引用并入本文，描述了若干衍生自选定 的真菌物种的磷酸甘油醛脱氢酶基因（GPDl)、翻译起始因子基因（TEFl)和假定的硬脂 酰-CoA- Δ 9-去饱和酶基因（FADl)的多核苷酸序列，其能够充当柄锈菌亚门和黑粉菌亚门 中基因表达的强启动子。由于重复使用相同或高度同源的启动子存在基因组不稳定性、重 复诱导的点突变（RIP)或RNA沉默导致的染色质表观遗传修饰和遗传修饰的风险（Horns et al，2012)，对于罕有经功能验证的启动子的柄锈菌亚门和黑粉菌亚门而言，非常需要扩 大的启动子库。 启动子是位于5'区邻接转录起始位点的DNA序列。其包括顺式作用DNA元件的 组合，所述元件与转录因子相互作用激活或抑制RNA聚合酶的转录。至今，已经公布胶粘 红酵母 ATCC 204091 (GenBank Accession :GL989638.1)、类酵母红冬孢 MTCC 457 (GenBank Accession :PRJNA112573)、类酵母红冬孢 NPll (GenBank :ALAUOOOOOOOO. 1)的基因组鸟枪 序列且已经公布禾木科红酵母（Rhodotorula graminis)WPl(http ://genome. jgi-psf. org/Rhobal_l/Rhobal_l. home.html)和红色掷抱酵母（Sporobolomyces roseus) (http : //genome, jgi-psf. org/Sporol/Sporol. home, html)基因组草图序列。类酵母红冬抱 NPll 所释放的RNA-Seq、蛋白组和基因组鸟枪数据（Zhu，Z.，et al，2012)不能明确功能启动子 的序列，因为启动子的活性受若干因素的影响，例如5'和3'末端的定位、转录后沉默、内含 子影响等。启动子在异源宿主物种中的活性更加无法预测。 专利技术概述 本专利技术涉及真菌生物技术的领域，更具体涉及在柄锈菌（Pucciniomycotina)亚 门和黑粉菌（Ustilaginomycotina)亚门物种中的强基因表达系统。 在第一方面，本专利技术提供多核苷酸序列，其作为红冬孢属（Rhodosporidium)、红酵 母属（Rhodotorula)、掷抱酵母属（Sporobolomyces)、Pseudozyma 或黑粉菌属（Ustilago) 中基因表达的强启动子起作用。这些多核苷酸序列在本文中有时称作多核苷酸启动子序 列。在一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID勵：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或 11中任一所示的序列。在另一实施方式中，所述多核苷酸启动子序列包含SEQ ID NO :1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、或11中任一所示的启动子序列，即不含克隆位点的序列。所述多核苷 酸启动子序列的每一个含有至少一个GAGGAG序列基序，其功能为在所述真菌物种中增强 基因表达。多核苷酸的每一个有效地在红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、Pseudozyma或黑 粉菌属中进行强基因表达。此外，这些多核苷酸启动子序列的可操作片段可以使用常规启 动子筛选测定分离以及可以被筛选用于使用本文描述的技术有效地选择经转化的真菌细 胞。在一实施方式中，可操作片段，本文也称作启动子部分，从ATG密码子-1位开始长度为 大约400碱基对至多达大约1100碱基对。如本文所用"多达"指的是所公开的SEQ ID NO 中所示的启动子的启动子部分的长度。因而，如果所公开的SEQ ID NO的启动子少于1100 个核苷酸，那么"多达"指的是启动子序列的最大长度。 在第二方面，本专利技术提供DNA构建体，其包含本文所描述的多核苷酸启动子序列、 可操作地连接的多肽编码序列和可操作地连接的RNA转录终止序列。可以使用本领域技术 人员熟知的任何真核转录终止子。这样的DNA构建体允许多肽在基因组偏向C和G的真菌 物种中的强表达。尤其相关的是选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种。所述尤其相关的物 种是红冬孢属、红酵母属、掷孢酵母属、黑粉菌属或Pseudozyma中的那些，其中存在大量物 种具有将可再生资源生物转化为高价值产品的巨大潜能，所述产品例如，甘油三酯、生物柴 油、脂肪醇、维生素、内酯、萜类化合物和生物表面活性剂。 附图简述 图1显示启动子的克隆和转化载体。pPN007和pRH2031均是基于pPZP200且含 有Umgpdl : :hpt-3潮霉素选择标记。RtGFP是针对富含GC的基因组优化的密码子优化的 GFP基因。 图本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA构建体，其包含与多肽编码序列可操作地连接的选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或其启动子部分的分离的核苷酸序列，所述多肽编码序列与转录终止子可操作地连接，其中所述DNA构建体使得所述多肽能够在选自柄锈菌(Pucciniomycotina)亚门和黑粉菌(Ustilaginomycotina)亚门的真菌物种中有效表达。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·I·程，N·彭，纪良辉，
申请(专利权)人：淡马锡生命科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG
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