本发明专利技术公开了一种双基因共表达重组载体，在初始载体中携带有基因表达框序列syn，所述基因表达框序列syn含有：终止子—多克隆位点—双向启动子序列PCarB—TA克隆制备序列—终止子，所述基因表达框序列syn的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示；在所述初始载体中还携带有潮霉素抗性基因hygR，所述潮霉素抗性基因hygR的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2；具体构建了一个双基因共表达重组载体pPMPT，为在初始载体pATZ中含有基因表达框序列syn和潮霉素抗性基因hygR，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO:3所示，同时还公开了该载体的构建方法以及在丝状真菌三孢布拉霉中的应用。本发明专利技术提供的重组载体可在一个质粒上同时添加两个基因，而且通过农杆菌介导可以整合到丝状真菌基因组中，以单拷贝插入，实现双基因共表达，其遗传稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因
，具体地说是一种双基因共表达重组载体及其构建方法 和在丝状真菌=抱布拉霉中的应用。
技术介绍
常规转基因多是利用单个目的基因改良生物的个别性状，但单个目的基因的转化 不能满足生物改良的需要，尤其是对一些代谢途径或数量性状的遗传修饰。随着基因工程 和分子生物学研究的深入，多基因转化研究应运而生，并迅速发展。 生物遗传转化多基因共表达系统通常包括多质粒共转化系统和单个载体表达多 个基因表达盒系统。在多质粒共转化系统中，是将多个外源基因分别克隆至不同的抗性载 体中，共转化后同时添加多种抗生素实现多基因的共表达，由于受到抗性标记种类及组合 方式的限制，运种系统仅能实现少数几个基因的共表达。此外，共表达时，还需要考虑多个 表达质粒的相容性，操作起来也比较麻烦，且转化效率不高。可见，单个载体表达多个基因 表达盒系统更具研究和应用价值。基因表达载体是指实施了目的基因，并且保证目的基因到达受体细胞能够表达的 运载体，基因表达载体的构成是在运载体的基础上构建的，基因表达载体所必须具备的组 成是启动子+目的基因+终止子+标记基因。多基因表达载体即可用于多个基因插入，能 让多个目的基因到达受体细胞并表达的载体。基因表达载体的构建是基因工程的核屯、，是将目的基因与运载体结合的过程，实 际上是不同来源的DNA重新组合的过程。通常是W分子遗传学为理论基础，W分子生物学 和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入活细胞，W改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。该过程如 果W质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末 端；然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可 切割出平末端，拥有相同效果）；将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互 补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氨键，再加入适量DNA连接酶，催化 两条DNA链之间形成憐酸二醋键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA 分子。如人的膜岛素基因就是通过运种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组 DNA分子（也叫重组质粒）的。目前，基因工程领域内所构建的表达载体多为原核和植物表达载体，如PUC-T为 经常用到的原核表达载体，但是不适合真核生物，而且常用的植物表达载体如PBI121、 PBI221等在真菌中使用也受到一定的局限性。此外，技术人员通常想要外源基因表达时需 选择合适的酶切位点借助酶切连接进行外源基因的插入使其转化宿主得W表达。而现有技 术中，本领域对于丝状真菌表达载体构建的研究较少，尤其专口针对于=抱布拉霉基因表 达载体的构建更是鲜有报道。 S抱布拉霉属于霜霉目、白诱科，拉下名是Blakeslea trispora，是目前大规模工 业化生产天然0-胡萝h素的主要菌种。该菌在使用过程中常需要对其进行遗传修饰，其 过程基本为：（1)扩增所需插入片段，（2)做T载体克隆进行酶切，（3)通过酶切连接进行 载体的构建。如，对=抱布拉霉进行修饰时常用的载体中有PCAMBIAI1303,所用启动子为 CaMV35S promoter,由于质粒上仅含有一个多克隆位点，其不能将PCR产物直接用于连接。 又如，李继刚等研究了丝状真菌转化载体的改进（河南农业科学，2013年05期），报道了 pATZ、pTBZ的构建过程，通过酶切连接所改进的载体含有抗性标记和多克隆位点，但是，如 果想要实现外源基因的表达，也需通过酶切连接的方式加上启动子，终止子和相应的目的 基因，而且在插入目标基因时，很难找到合适的酶切位点，而且有些酶活性较低，会给操作 带来很大麻烦。再如，CN1759174A公开了遗传修饰布拉霉属生物的方法、相应的生物及其 用途，利用地inA载体构建了地inAHy曲载体，该载体含有潮霉素抗性和一个介于启动子和 终止子之间的多克隆位点，选择合适的酶切位点利用酶切连接的方式可在多克隆位点处插 入任意一个基因，构建好要表达的载体，然后运用农杆菌介导的方式，转化=抱布拉霉中的 至少一个细胞，通过诱变等方式进行同核转变，使一个或多个细胞都获得一样的遗传性状， W使其得到稳定遗传，但是，其仅限于加入单个基因，如果想表达多个基因还需加入多个启 动子，则需多次借助外源载体进行连接，或通过共转化才能得W实现，其不仅操作过程繁琐 复杂，而且容易导致基因表达量不一致、反义失活W及遗传不稳定；此外，对插入含有多个 酶切位点的长片段目标基因也造成一定困难。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种双基因共表达重组载体及其构建方法和在=抱布拉 霉中的应用，W解决现有的表达载体所存在表达两个W上基因时需要进行多次外源基因的 整合，操作繁琐，W及基因表达量不一致、反义失活W及遗传不稳定等问题。 本专利技术的目的是通过W下技术方案实现的： 一种双基因共表达重组载体，W初始载体为骨架携带有完整的基因表达框序列 syn，所述序列syn含有：终止子序列（Ter)-多克隆位点（MC巧一双向启动子序列PCarB-TA克隆制备序列一终止子序列灯er)，该基因syn的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示； 其中终止子灯er)、多克隆位点（MCS)、双向启动子PCarB、TA克隆位点、终止 子灯er)各自的分子量大小依次为55%口、436口、6106口、286口、55%口，在核巧酸序列56化 I化NO: 1上从前到后依次排列。所述初始载体为pATZ、pPZPlOO、pPZPlOl、PPZP102、pPZPlll、PPZP112、PPZP121、 PPZP122、PPZP200、PPZP201、PPZP202、PPZP211、PPZP212、PPZP221 或PPZP222 中的任意一 种；优选为pATZ。 本专利技术构建了一种丝状真菌表达一个或同时表达两个外源基因的重组载体，通过 在双向启动子一侧加入多克隆位点，另一侧加入TA克隆，使外源基因的导入操作更方便快 捷；通过在丝状真菌=抱布拉霉的应用实验证明，在重组载体上同时添加上两个目标基因， 并通过农杆菌介导可W整合到=抱布拉霉基因组中，W单拷贝插入，稳定遗传。 本专利技术提供的双基因共表达重组载体在所述载体中还携带有潮霉素抗性基因 hygR，可作为重组子筛选的标记基因，所述潮霉素抗性基因hy曲的核巧酸序列如SE化 ID.NO:2 所示。 本专利技术还提供了一种双基因共表达重组载体pPMPT，W初始载体pATZ为骨架携带 有基因表达框序列syn，并W潮霉素抗性基因hy曲作为筛选标记基因，所述基因表达框序 列syn含有：终止子序列灯er)-多克隆位点（MC巧一双向启动子序列PCa巧一TA克隆制 备序列一终止子序列灯er)，其核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示；所述潮霉素抗性基因hy曲 的核巧酸序列如SE化ID.NO:2所示；其质粒图谱为： 所述重组载体pPMPT的核巧酸序列如沈QIDNO: 3所示。 本专利技术提供的双基因共表达重组载体pPMPT的构建方法，包括W下步骤： (a)按照如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列人工合成完整的基因表达框序列syn， 并克隆于载体PMD19-T中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双基因共表达重组载体，其特征在于，以初始载体为骨架携带有基因表达框序列syn，所述序列syn含有：终止子序列—多克隆位点—双向启动子序列PCarB—TA克隆制备序列—终止子序列，所述序列syn的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张利平，高新芝，汤晖，李继刚，杨普城，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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